Tema 3

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Methods for virus production,purification and titration.

Vectores virales : el ciclo vital del virus tiene un sistema de integracion o no. El tipo de material genetico es con o sin envuelta.Una particula viral esta compuesta por acidos nucleicos y algunos proteinas que impiden su degradacion en el medio extracelular y median su internalizacion en las celulas diana es decir que necesita una celula huesped para replicarse.

En terminos generalesl proceso de replicacion viral esta sostenido por la interaccion de varias proteinas virales o celulares ( trans) con sus respectivas targets en el genoma viral (cis).

Para construir un vector virico se debe eliminar la mayoria de genes codificantes para proteinas virales earticular los que tienen un potencial patogeno. Manteners secuencias cis del genoma viral para la replicacion y separamos las funciones trans.

El tamaño del transgen depende del genoma original . Se debe construir el vector mas seguro y menos toxico.

Lo esencial es que al ser liberada la particula virica no pueda replicarse de manera autonoma.

Retrovirus: Los retrovirus no son capaces de pasar la membrana nuclear es por eso que no pueden integrarse en el genoma. Los vectores virales tienen que tener siempre las secuencias cis que ncluyen un promotor U3 para la inicio d ela transcripcion , una region para la retrotranscripcion y una region U5 de polyadenylacion. Por separado tenemos la secuencia codificante para 3 enzimas que son la RT, la PT y la IN. Luego la señal de la capsida.

Self Inactivating: el objetivo es que la particula virica al introduccirse y aportale las sec trans se replique UNA sola vez. La RT nesecita U3 en el momento que U3 es mutado al retrotranscribirse se pierde la capacidad de transcribirse autonomamente.

Packaging cell : Ambiente celular necesario para producir uestra particula viral infecciosa cargada con el transgen

Tropismo o pseudotipado : cambiar tropismo o especificidad de un virus determinado modificando las secuencias trans que codifican para los genes de envuelta.

Lentivirus: Pueden acceder al nucleo , el ciclo vital es latente es decir que no pasa por una fase de destruccion celular para su replicacion.

Un vector es de mas alta generacion cuando tiene originalmente menos secuencias viricas y cuanto mas separadas estan las secuencias trans.

A veces para aumentar la seguridad se disminuye la eficiencia de replicacion del virus

Adenovirus: contiene una fase litica. Usa la maquinaria de la celula para su beneficio , la fuerza a entrar en fase S para su replicacion y una vez salga la va a ligar. Fundamentalmente se quita el E1 que se requiere para la activacion de la transcripcion del genoma virico desde los extremos ITRS

Adenoasociados: Su tamaño es limitante , tiene una fase litica y no se integra si tiene las secuencias trans necesarias.

El Sendai virus: no produce ninguna enfermedad conocida ni un tumor pero el SI lo detecta y produce una fuerte cantidad de citoquinas.

Un virus con envuelta es mas resistente a centrifugaciones o filtrados, las propiedades fiscico quimicas afectan los metodos de purificacion.

Metodos de clarificacion: Centrifugacion para eliminar débris celulares , Microfiltracion para filtrar el sobrenadante.

Metodos de concentracion : Precipitar uso de cojines de sacarosa para que el paso por ese cojin amortigüe la fuerza de centrifugacion , precipitacion con aditivos (sales), ultrafiltracion ( metodo escalable).

Metodos de purificacion Lo haremos o no en funcion de cuan puro tiene que estar el virus: Gradiente de densidad/Ultracentrifugacion,cromatografia purifica el vector viral en base a las propiedades de la superficie de las particulas virales.

Metodos de titulacion: Ensayo proteico cuantifica o la cantidad de proteina o la cantidad de una proteina viral especifica. ELISA cuantifica el n° de proteinas viricas no el de particulas viricas. Microscopia electronica para detectar las particulas viricas en solucion. Citomatria de flujo,qPCR.

Una titulacion funcional es definida como el numero de particulas viricas funcionales requeridas para trasnducir una celula presente en un determinado volumen.