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| Question | Answer |
| Generalidades del dx de laboratorio | -Fin basico de la microscopia: identificacion de microorganismos. Coloracion Gram es la es la base de la coloracion clinica., permite conocer la estructura de la pared. -Escenario epidemiologico: frecuencia con que aparecen los microorganismos. -Clasificación clínica: con tincion Gram, define morfología. -Clasificación taxonómica: usa el indice de guanina y citosina. |
| Métodos microscópicos | -Microscopia de campo claro (óptica): la muestra se ve mediante transiluminacion. Se utiliza para microorganismos grandes y detalles morfológicos, no se ven virus. Tiene como limitación la resolución de la imagen. Resolución 0,2 um. -Microscopia de campo oscuro: Igual que campo claro pero con un condensador especial. Capacidad de resolución mayor (0,02 um). Como desventaja no se puede observar estructura interna. -Microscopia de contraste de fases: Permite ver detalles internos, sin coloración. Para especímenes delgados o células aisladas. Para tejidos vivos. -Microscopia fluorescente -Microscopia electrónica: Se pueden observar partículas víricas. Dos tipos: de transmisión y de barrido (imagen 3D). |
| Métodos de estudio | -Estudio directo: Mas sencillo. La muestra se puede suspender en agua o suero. Una variación es el método de tinta china. -Tinciones diferenciales: Para teñir microorganismos específicos. Gram es la mas conocida. Se puede utilizar como punto inicial de la identificación bacteriana tomando con un anza la colonia. Se utiliza en la bacteriemia (hemocultivos) y para identificación en caldos. En placa la concentración 100 bacterias/ml. Confirma genoespecie. -Tincion ácido-resistente o de Ziehl-Nielsen: Se precisa calentar la muestra durante la tincion. Se sustituye por tincion fluorocromica: tincion de elección. -Tincion fluorescente: Para detección rápida de microorganismos. |
| Metodos de tincion directa | -Preparación en fresco: No teñida, se estudia mediante microscopia de campo oscuro, claro o contraste de fases. -KOH al 10%: disuelve el material proteinaceo. Para elementos fungicos. -Tincha china: Modificación de KOH 10%. -Yodo de Lugol: Se añade yodo a muestras frescas de parasitologia. |
| Tinciones diferenciales | -Tincion de Gram: Mas utilizada. divide en Gram+ y Gram-. Gram+ retienen colorante, Gram- no retiene colorante (solo safranina). -Tincion de hematoxilina ferrica: Para protozoos fecales. Mejor en preparaciones en fresco. -Metenamina de plata: Se utiliza en histologia -Azul de toluidina O: para muestras del genero Pneumocystis en muestras respiratorias. -Tincion tricromica: Alternativa a hematoxilina ferrica.. Tincion de Wright-Giemsa: Para parasitos sanguineos, cuerpos de inclusión vi ricos y por clamidias. |
| Tinciones acido resistentes | -Tincion de Ziehl.-Nielsen: Para micobacterias y microorganismos resistentes. Precisa calentamiento de la muestra. -Tincion de Kinyoun: Acidorresistente en frío. |
| Tincion fluorescente | -Tincion de naranja de acridina: para hongos y bacterias de muestras clínicas. -Tincion directa con ac fluorescentes: los ac forman complejos con moléculas fluorescentes. |
| Medios de cultivos no selectivos | -Están diseñados para el crecimiento de la mayor parte de germenes sin condiciones exigentes. -Agar sangre, -Agar chocolate (agar sangre calentado), -Agar Mueller Hinton (para sensibilidad bacteriana, ternera, caseina, sales y almidón soluble) -Caldo tioglicolato (enriquecido, caseina, glucosa, extracto de levadura, cisteina y tioglicolato solido. Hemina y Vit K p/ bacterias anaerobias) -Agar dextrosa de sabouraud (cultivo enriquecido para aislar hongos) |
| Medios de cultivo selectivos y diferenciados | -Para recuperar germenes específicos. Se enriquecen con inhibidores para otros germenes. -Agar McConkey: para Gram- y para diferenciar las fermentadoras de lactosa de las que no.. -Agar sal manitol: Para aislamiento de estafilococos. -XLD: para Salmonella y Shigella en cultivos entericos. Se las diferencian porque Salmonella se vuelve negra en presencia de citrato amonico ferrico. -LJ: Para aislar micobacterias. Se añade verde malaquita para inhibir Gram+. Agara Middlebook igual, pero se solidifica. -CHROmagar: Para cándida. Tiene cloranfenicol para inhibir bacterias. |
| Cultivo Celular | Cultivos en células vivas. |
| Métodos fenotipicos tradicionales | -Permite ver aquello que se expresa del genoma. En desuso. -Características microscópicas y morfologia de la colonia -Medios selectivos y/o cromogenicos. -Pruebas bioquímicas para características metabólicas. -Sensibilidad o resistencia a algún antimicrobiano. |
| Sistemas fenotipicos semiautomatizados | -Permite probar gran cantidad de sustratos simultáneamente. -Interpretación con códigos numéricos. -Lectura rápida |
| Sistemas fenotipicos totalmente automatizados | -Utilizan sustratos liofilizados -Prueba de sensibilidad a los ATB -Resolución del código automático |
| Metodos genotipicos | -Observan ADN cromosomal o ARNr -Más difundido es el housekeeping ARNr 16s -La base de secuencias alcanza 10000 bacterias -Permite establecer relaciones filogeneticas entre bacterias -Utiliza secuencias ARNr 23s -También utiliza subunidad beta del gen ropB. La subunidad es variable, por lo que es mas ESPECIFICO. |
| Sistemas proteomicos | -Lee las proteínas que sintetizan las bacterias -Utiliza espectroscopia de masa -Se basan el proteínas ribosomicas -Guarda base de datos mundial. |
| Diagnostico molecular | -Sensibles, específicos y seguros -No requieren el aislamiento del agente infeccioso, solo su material genetico. -Por su sensibilidad detectan muestras muy diluidas de ADN -Distingue cepas basándose en diferencias genotipicas. Distingue cepas resistentes -Se 70-99% -Es 86-100% -Tiempo de detección 1-4 horas. -Tiene como limitacion el costo del test. -Microarrays: consiste en un chip a la cual se le unen fragmentos de ADN, los que se uniran o no al encontrarse con una secuencia de ADN complementaria presente en la muestra. -ARNr 16s: incluidos en la subunidad 30s. Alto grado de conservacion. Al ser diana de ATB, muta a resistencia ATB. -16s-23s ARNr: se utiliza para identificacion, filogenia y/o tipificacion. Muy variable. -ARNr 23s: Costoso. Metodo auxiliar con fines taxonomicos y filogeneticos. -rpoB: subunidad beta de la ARN polimerasa, cronometro molecular de alta potencia. Mayor calidad. Genotipificacion y filogenia. Mas adecuado para identificacion a nivel especie y subespecie. -gyrB: subunidad beta de la ADN girasa o topoisomerasa II |
| Detección de material genético microbiano | -Análisis electroforetico del ADN: separa fragmentos de ADN y aplica una corriente que mantiene las moleculas de interes. Utiliza enzimas de restriccion que reconocen secuencias concretas de ADN de secuencia palindromica (se lee igual en ambas cadenas, forman una doble helice). -Los fragmentos de ADN de diferente tamaño se pueden distinguir por su movilidad electroforetica en gel de agarosa o poliacrilamida. -Fragmentos pequeños de virus o plasmidos se ven con metodos electroforeticos normales. Fragmentos grandes solo con gel en campo pulsado. -Usa ARNr 16s para identificar bacterias. |
| Sonda de ADN | -Fragmentos pequeños de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza para encontrar su cadena complementaria. Se marca con marcados radioactivo. -Permiten detectar, localizar y cuantificar, secuenicas de ac nucleicos. Alta especificidad y sensibilidad detectan cepas, aun en ausencia de replicacion. -Se sintetizan x metodos quimicos o por clonacion en forma de plasmidos. Las copias de ADN de los virus de ARN se fabrican con transcriptasa inversa retrovirica. |
| Hibridacion | -Proceso donde se combinan dos cadenas simples de ADN o ARN formando molécula de doble hélice. En el proceso contrario, se rompe la doble helice --Cuando se usa fluorescencia se denomina método FISH (hibridacion fluorescente in vitro), para detección de ADN o ARN en su ubicación real.. -Si se agrega nitrocelulosa se denomina dot blot. Southern Blot: hibridacion de sonda de ADN:ADN Northern Blot: hibridacion de sonda ARN: ADN |
| ¿Que es una transcriptasa inversa? | -DNA polimerasa presente en retrovirus que puede utilizar ADN o ARN como patron. -Es la diana de los diversos fármacos del virus del SIDA. |
| PCR | -Reaccion en cadena de polimerasa -Amplifica copias simples de cadenas de ADN virico mediante termociclador. -Permite buscar secuencias conservadas en ADN de microorganismos: caracterizacion. -En caso de secuencia de gen ARNr 16s: conocer que bacteria es. -Se incuban secuencias cortas de ADN: primers o cebadores. Estables termicos. La muestra se calienta para separar las cadenas y se enfria para permitir hibridacion. -Util para deteccion de virus latentes como retrovirus, herpesvirus, virus del papiloma y virus de ADN. -PCR basica requiere de : muestra de ADN con segmento que se quiere amplificar, cebadores o primers (oligonucleotidos), desoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) y ADN polimerasa. |
| RT-PCR | -Transcriptasa inversa -Detecta un microorganismo por vez directamente de la muestra que esta en un cartucho con primers para un organismo en particular (SAMR, micobacterias, C. difficile, chlamydia, enterovirus, flu virus). -Detecta germenes resistentes. -Cuantifica la cantidad de ADN o ARN. Mientras mayor sea la cantidad de ADN, mayor sera la velocidad de sintesis. |
| MULTIPLEX-Film Array | -Detecta varios germenes (27 a la vez). Utiliza chips informaticos para detectar cada germen. -Tiene paneles para infecciones respiratorias, gastrointestinales y sepsis. -Requiere mas de 100 ufc/ml |
| LUMINEX x TAG | -Detecta varios germenes en el mismo ensayo -Panel para infecciones respiratorias y gastrointestinales -Investiga bacterias y/o virus en cada panel. |
| Branched DNA | -Nueva alternativa a PCR y RP-PCR. -Detecta pequeñas cantidades de secuencias especificas de ADN o ARN. -Util para cuantificar viremia plasmatica (concentraciones plasmaticas de VIH). -Utiliza la subunidad 16s para identificar bacterias especificas |
| SDS-PAGE | -Detecta proteinas. -Separa proteinas por su movilidad electroforetica -Se puede utilizar para distinguir diferentes cepas viricas o bacterianas. -Se desnaturaliza las proteinas eliminando la estructura secundaria y terciaria, sin romper los enlaces disulfuro y confiere una carga negativa de acuerdo a su masa. -Las proteinas migran de acuerdo a su masa. -Si no se utiliza SDS se llama PAGE nativa. |
| Desventajas de la identificacion molecular | -Calidad de muestra disminuida y erronea asigancion de especie. -Baja correlacion entre la identificacion genotipica y fenotipica. -Baja resolucion en la identificacion mediante ARNr 16s. |
| Proteomica | -MALDIT-TOF -Basados en el estudio del conjunto de proteinas expresadas por el genoma (proteoma). -Las mas usadas se basan en electroforesis y espectrometria de masas. -Espectrometria de masas: Analiza la composicion de diferentes elementos quimicos en funcion de su relacion masa/carga. El espectro de masa de cada compuesto es la huella quimica.. Se utiliza la proteina del ribosoma 16s. -La separacion de iones se produce segun el tiempo de vuelo. -No requiere infraestructura |
| Pasos para identificación mediante MALDI-TOF | -Detectan proteinas ribosomicas S y L -Recuperacion de colonia aislada en placa de metal pulido reutilizable (96 a 348 muestras) Se ionizan las muestras. -Realizacion de un espectro de masas (medicion) -Comparacion con base de datos -Entrega de resultados. -Una vez ionizadas las proteinas, viajan por una camara de vacio, siendo detectadas al final mediante un electrodo negativo o de aceleracion. El tiempo que tarde en llegar al final es el tiempo de vuelo de cada fragmento. El tiempo de vuelo sera mayor cuando menor sea la masa. Se compara el espectro con un archivo y se entrega el resultado. -Se utiliza directo una colonia y compara huella frente a bacterias desconocidas. -Se recomienda no mas de 24-48 hs de incubacion del cultivo. |
| Indetificacion a partir de hemocultivo | -3 pasos: separacion de celulas, preciptacion de proteinas y extraccion y solubilizacion de proteinas. -Se utilizan de 0,2 a 5 mL de sangre. -Se centrifuga y se produce la lisis , se lava y precipita con etanol. -Problema potencial: presencia de mas de un microorganismo. Es fundamental la tincion de Gram. |
| Identificacion a partir de muestra de orina | -Se puede utilizar orina sin procesar. -Se toman 4 mL que se somenten a centrifugaciones sucesivas con velocidades de centrifugacion crecientes. -Identificacion de mas del 90% a nivel genero o especie en muestras con mas de 105 ufc/mL |
| Resultados según metodología | -Se puede obtener: #Genero #Genero + especie #Genero + grupo #Subespecie. -En pruebas fenotipicas se puede llegar a genero + especie o genero y grupo -En pruebas de biologia molecular/proteomica a genero y especie, a veces a subespecie. |
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