PROCESO DE REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO POR MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.

REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO

POR MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.

Preparar un tubo problema y un tubo testigo.

Añadir 1.0 mL de Preparación cruda de Transaminasa

Agregar 0.5 mL de Alanina 100 μmoles/ml.

Preincubar los tubos a 37° C durante 5 minutos.

Añadir 0.5 mL de agua destilada únicamente al tubo testigo.

Agregar 0.5 mL de ácido alfa-cetoglutárico 100

μmoles/mL al tubo problema.

Incubar los tubos a 37° C durante 1 hora con agitación ocasional.

Adicionar 4.0 mL de alcohol 96°.

Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm.

Pasar el sobrenadante a un vaso de precipitados y evaporar casi a sequedad en una placa de calentamiento.

Disolver los residuos con 1 mL de agua destilada.

REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN

PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA.

Cortar una tira de papel Whatman No. 1 de 23 x 57 cm

Trazar con lápiz, a lo

ancho del papel, tres líneas paralelas a 2.5, 6.0 y 8.0 cm en total a partir de uno de

los extremos.

Doblar sobre la primera línea hacia el frente y sobre la segunda hacia

atrás.

Marcar con lápiz en la última línea (8.0 cm) nueve puntos equidistantes.

En los primeros cinco puntos colocar 5, 10, 15, 20 y 25 PL respectivamente, de

una solución de ácido glutámico de 20 Pmoles/mL.

Usando un secador de aire

caliente después de cada aplicación.

Colocar respectivamente, en los cuatro puntos restantes, 60 PL de los tubos P y T de la reacción de transaminación, 20 PL de agua (testigo para ajustar el espectrofotómetro), y 5 PL de la solución tipo de alanina.

Secando con un secador

de aire caliente después de cada aplicación.

Saturar el cromatograma durante dos horas en una cámara de cromatografía

previamente saturada con el disolvente etanol:metanol:agua-urea (45:45:10:0.5

v/v/v/p)

Desarrollar el cromatograma durante 18 horas aproximadamente con el

disolvente utilizado, hasta que éste haya recorrido tres cuartas partes del

cromatograma.

Sacar el cromatograma de la cámara, marcar el frente de corrimiento y dejarlo

secar en la estufa para cromatografía a 70° C hasta evaporar el disolvente.

REVELADO Y ELUCIÓN DE LAS MUESTRAS

Revelar el cromatograma por aspersión con una solución de ninhidrina al 0.05% en etanol.

Colocar el cromatograma en la estufa para cromatografía a 80° C hasta que aparezcan ligeramente las manchas.

Recortar las manchas correspondientes a la curva tipo de ácido glutámico y

también las manchas correspondientes al ácido glutámico formado en los tubos P y

T de la reacción de transaminación.

Recortar una porción de papel a la misma distancia recorrida por el ácido glutámico en el carril donde se aplicó el agua (testigo para ajustar el espectrofotómetro).

Fragmentar cada una de las porciones de papel y colocarlas en tubos de ensayo, añadir 1 ml de solución de ninhidrina al 1% en butanol para eluir las muestras.

Colocar los tubos de ensayo en baño maría a 80oC durante 2 minutos. Enfriar en baño con hielo y agregar a cada tubo 5 mL de acetona al 75%.

Leer en el espectrofotómetro a 540 nm. Ajustar con el testigo correspondiente.

Calcular la concentración de ácido glutámico obtenido por acción de la

transaminasa.