Práctica 11 Inmunoensayo enzimático (ELISA)

Práctica 11 Inmunoensayo enzimático (ELISA)

1. Objetivo general

   • Conocer el fundamento teórico y los usos de la prueba de ELISA, mediante una prueba indirecta, para interpretar los resultados y aplicarlos en el diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas en medicina veterinaria.

2. Objetivos particulares

   • 1. Realizar la prueba de ELISA indirecta para el diagnóstico de micoplasmosis (Mycoplasma hyopneumoniae), mediante el empleo de sueros sanguíneos de cerdo para identificar reacciones positivas y negativas.
   • 2. Identificar las modalidades de la prueba de ELISA mediante el análisis de los fundamentos de cada prueba para establecer sus aplicaciones en la práctica veterinaria.

3. Importancia

   • La técnica de ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima (conjugado), de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al fijar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) sobre un soporte, la reacción antígeno- anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, al adicionar el conjugado y su sustrato específico, se producirá un color observable a simple vista y cuantificable espectrofotométricamente.

4. ¿DE QUÉ CONSTA LA PRUEBA DE ELISA?

   • Constan de los siguientes elementos: fase sólida, antígeno, anticuerpo, control positivo, control negativo, conjugado, enzima, sustrato y muestra.
   • Es el analito que se puede fijar a la fase solida; puede ser el elemento conocido o provenir de la muestra a determinar (elemento
     • Antígeno
   • Fase sólida.
     • Es la placa de 96 pozos de fondo plano, donde las moléculas de Antígenos o Anticuerpos se unen con la superficie de la placa a través de las fuerzas electroestáticas. La placa puede ser de poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon o silicona. Los mejores resultados se obtienen con el poliestireno y el polivinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades de unión.
   • Anticuerpo.
     • Al igual que el antígeno, puede estar fijado en la placa (elemento conocido) o ser la muestra a probar (elemento desconocido). Los anticuerpos para la técnica de ELISA son monoclonales o policlonales.
   • Control positivo. Suero con un título de anticuerpos conocidos y específicos contra el antígeno. Control negativo. Suero sin anticuerpos contra el antígeno. Ambos controles aseguran que la prueba está funcionando correctamente.
   • Conjugado. Antígeno o anticuerpo unido a una enzima. Dicho conjugado debe mantener estables sus propiedades inmunológicas y enzimáticas.
   • Enzima. debe acoplarse fácilmente a antígenos o anticuerpos, ser estable tanto libre como conjugada, ser altamente reactiva, encontrarse en estado puro, disponible, a precio razonable y ser segura. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa.
   • Sustrato. Es una sustancia que modifica su estructura tras reaccionar con su enzima específica y produce un cambio que detectan los sistemas colorimétricos, fluorescentes y luminiscentes. La elección del sustrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura y estabilidad después de la reacción. Requerimientos del sustrato: solubles en agua, fácil de manipular, no tóxicos, no mutagénicos y de bajo costo. Los más utilizados son TMB (3-3´-5-´- tetrametilbenzidina), ABTS (sal diamino del ácido 2-2-azino-di-(3 etil - benzotiazolinsulfónico- 6), OPD (O-fenilendiamina) y tolidina
   • Muestra. Puede ser: saliva, suero, plasma, orina, heces, sangre, etcétera.

5. Clasificación de las pruebas de ELISA

   • ELISA indirecta
     • Esta modalidad se diseña para detectar los anticuerpos que el individuo ha creado contra el antígeno. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado con la enzima.
   • ELISA sándwich
     • Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos. En esta modalidad se usan dos tipos de anticuerpo contra el antígeno específico, uno sin marcar y otro marcado, el primero se encuentra fijado a la placa y el segundo se añadirá después de haber agregado la muestra problema (antígeno).
   • ELISA competitiva
     • En esta modalidad, el anticuerpo de la muestra competirá con el conjugado (anticuerpo marcado) por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Para ello, se fija a la placa el antígeno, se agrega el suero problema y posteriormente se añade un conjugado contra el antígeno, se adiciona el sustrato sobre el que sea capaz Práctica 11  Inmunoensayo enzimático (elisa) 117 El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018) de actuar la enzima marcadora. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra. La diferencia de densidad óptica es proporcional a la concentración del anticuerpo problema en la muestra.

6. Usos de la prueba

   • Enfermedades producidas por parásitos: babesias y tripanosomas, Toxocara canis, toxoplasmosis, triquinosis.
   • Enfermedades producidas por micoplasmas.
   • Enfermedades producidas por bacterias y sus productos: paratuberculosis, brucelosis, enterotoxinas, estreptococosis, salmonelosis.
   • Enfermedades producidas por virus: Aujeszky, Newcastle, fiebre aftosa, leucemia felina, peste porcina africana, peste porcina clásica, rinotraqueitis infecciosa bovina, rotavirus y artritis viral equina.
   • Determinación de hormonas, quimiocinas, citocinas u otros antígenos en muestras como saliva, orina, plasma, etcétera.

7. HECHO POR: EDUARDO MOLINA

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