DNA cromosomal

DNA cromosomal

1. "Purificación Salina"

   • Pasos
     • 1. Lisis celular
       • Mediante un detergente aniónico en presencia de conservantes y tratamiento con RNAsa
       • 2. Se eliminan proteínas y contaminantes celulares
         • Mediante precipitación salina
         • 3. Aislamiento de DNA genómico
           • Precipitación en presencia de alcohol y se disuelve en agua o slc. conservante

2. Aislamiento

   • 1. Preparación de muestras
     • Muestra fresca o congelada, se guardaran 10 mL de la muestra en congelación hasta su uso
     • 2. Lisis celular
       • Añadir 0.5 mL de suspeción bacteriana en un tubo eppendorf
         • Centrifugar a 13.000–16.000 g durante 5 segundos. Eliminar el máximo posible de sobrenadante
           • -Añadir 300 µl de la solución de lisis y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que las células queden resuspendidas de nuevo.
             • Incubar la muestra a 80 ºC durante 5 minutos para lisar las células.
               • Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente.
       • 3. Digestión de RNA
         • Añadir 1.5 µl de la solución de RNAsa A al lisado celular. Mezclar bien la muestra, invirtiendo el tubo 25 veces. Incubar a 37 ºC durante 15–60 minutos.
         • 4. Precipitación de proteínas
           • Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente. Añadir 100 µl de la solución de precipitación de proteínas al lisado celular previamente tratado con RNAsa y agitar vigorosamente durante 20 segundos, y centrifugar a 13.000–16.000 g durante 3 minutos.
           • 5. Precipitación de DNA
             • Decantar el sobrenadante (que contiene el DNA) a un tubo Eppendorf de 1’5 ml que contenga 300 µl de isopropanol puro
               • Mezclar la muestra y centrifugar a 13000-16000 x 1 min
                 • Eliminar el sobranadante por decantación
                   • Añadir 300 µl de etanol al 70%. Invertir el tubo varias veces
                     • Centrigugar a 13000-16000 x 1 min, posteriormente eliminar el EtOH por decantación
                       • Escurrir el tubo en papel absorbente y dejar secar la muestra
             • 6. Hidratación de DNA
               • Añadir 50 µl de la solución de hidratación del DNA
                 • Rehidratar el DNA a T amb durante toda la noche / Calentar a 65°C x 1 hr
                   • Guardar el DNA de 2-8°C hasta sy uso

3. Visualización en gel de agarosa