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METODOLOGIA IGNAR PYES2/Ct
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Clonación y expresión del transgén codificante a IgNAR
1.-Obterner la secuencia codificante al anticuerpo IgNAR
1.1 Diseño de primers y corrimiento de una PCR degenerada
1.2 Síntesis de la secuencia
Se usarán pimers (5` y 3`)degenerados con sitios de reconocimiento por enzimas de restricción (HindII/Xba1) presentes homólogamente en el plásmido , dejando una secuencia (TAGCA) acomplementaria y un codón de inicio (ATG)
Se correrá una PCR con primers degenerados, y se hara la amplificación del gen, por medio de una el
Obtener una muestra de ADN del tiburón Triakis scyllium I
Teniendo el numero de acceso en gene bank de la CLONA 1 se mandará a sintetizar con sus respectivos sitios de restricción en los extremos aunado a la secuencia acomplementaria (TAGCA) en los extremos 5 y 3` para garantizar la acción digestiva de las endonucleasa
2.Inserción del gen al shuttle
2.1.-Digestión del plasmido y del gen con EcorI/HindII.Ligado (ligasas)
3. Electroporación de HOST de clonación en E.coli Top 10 , DH5, o JM109
4.- Inserción del gen en la biofábrica (E.coli)
5.-Sembrado de E.coli en medio LB enriquecido con ampicilina para selección a 37ºC
6.-Seleccionar las E.coli en fase exponencial media y reposar en glicerol a -80ºC antes de realizar la lisis para la transformación de levadura
7.- Cultivo de la cepa INVSc1 S. Cerevisiae en un medio YPD a 30ºC
8.- Lisiar las E.coli transgénicas previamente seleccionadas por controles positivos en medio rico en ampicilina
9.-Extraer material genético de la E.coli, con un miniprep (Invitrogem,USA)
Nota: Para corroborar la inserción se realiza una PCR con los primers propuestos para amplificación del gen codificante a IgNAR
10.- Realizar la competencia de la levadura a través del kit de químico competencia provisto por e S.c. EasyComp™ Kit (Invitrogem,USA).
11. Usando el material ADN plásmidico extraido en el paso 9 realizadr la transformación de las levaduras quimico competentes
12.- Cultivar en un medio YDP pobre en uracilo (marcador de selección)
13.- La células (UFC) observables serán las portadoras del plásmido PYES2/CT
14.- Realizar pruebas y protocolos de sanidad para uso de IgNAR en humanos