Técnicas Histológicas

Técnicas Histológicas

1. Coleta de Material

   • Pode ser feita por meios cirúrgicos, ou em necropsias, com o auxílio de bisturis, pinças ou lâminas cortantes, tendo o cuidado imediato de imergir a amostra em líquido fixador para que a morte do tecido seja interrompida.
   • Para coleta ter uma maior eficácia o processo deve ser feito com muito cuidado por conta da fragilidade das amostras, podendo alterar o resultado da análise, já que uma forma errada de manuseio ou um instrumento errado pode, por vez, causar uma lesão no tecido.

2. Fixação

   • Quando se faz a coleta de um material, o tecido automaticamente entra em estado de autólise celular (estado de deterioração das células, já que quando o material é retirado do corpo ele deixa de ser oxigenado, e ocorre proliferação de microrganismos), é utilizado procedimentos físicos-químicos para impedir a autólise, e dar mais resistência ao tecido.
   • Um fixador muito utilizado é o Formol, no entanto ele não tem um resultado muito satisfatório, então ocorre uma dissolução de formol em tampão fosfatado
     • • Formol (solução a 37% de formaldeído): 100mL • Água destilada: 900mL • Fosfato de sódio monobásico: 4,0g • Fosfato de sódio dibásico (anidro):6,5g
   • O volume de fixador deve ser 20 vezes maior que a amostra, e o tempo de fixação pode variar de 6h a 24h. Após ser fixado o material deve transferido para álcool 70% podendo ficar por tempo indefinido. O líquido de Bouin tem a seguinte fórmula:
     • • Solução aquosa saturada de ácido pícrico: 75mL • Formol: 25mL • Ácido Acético: 5mL
     • Para remover o excesso de fixador dos tecidos é recomendado: 1º - Lavagem em água corrente por 18h; 2º - Transferência de peã para álcool 50%, durante 30 minutos; 3º - Armazenamento em álcool 70%.

3. Clivagem

   • A clivagem ocorre logo após a fixação, com o intuito de diminuir o tamanho da amostra na quantidade necessária em que o fixador atue de uma forma mais rápida para impedir a autólise.
     • O padrão de espessura do tecido deve ser 3 milímetros (mm), porém em certos casos específicos podem chegar a 5 milímetros (mm).
   • Durante a fixação ocorre uma alteração na estrutura da amostra, e o processo de clivagem é feito justamente para reparar essa alteração, normalmente usando instrumentos como gilete, para dar uma superfície lisa

4. Descalcificação

   • Em tecidos que contém muitos sais de cálcio - como ossos e dentes – ocorre uma rigidez na amostra, que pode complicar a realização de cortes finos, causando complicações nas análises, além de que ao fazer o corte pelo processo de clivagem pode causar a formação de “dentes” no material. Por tal motivo é necessário que os sais sejam retirados, deixando as amostras mais maleáveis para o corte.
   • Não existe um método de descalcificação padronizada, podem ser físicos e químicos, dependendo da amostra que vai ser descalcificada, do fixador utilizado anteriormente, e da urgência da análise.
     • DESCALCIFICAÇÃO POR ÁCIDO
       • O uso de ácidos da descalcificação contém a vantagem de ser um método simples, no entanto é indicado fazer um banho neutralizante nas amostras com hidróxido de amônia ou oxalato de amônia ou sódio, logo após a descalcificação, já que contém como desvantagem a hidrólise da matriz óssea (um processo químico que ocorre quebra de moléculas na presença de água) e destruição de enzimas, ácidos nucleicos e polissacarídeos.
         • Existem diferentes tipos de ácidos que podem ser usados nesse processo, contendo ácidos fortes (como: ácidos nítricos e ácido clorídrico) e ácidos fracos (como: ácido fórmico, ácido acético e ácido pícrico). Os ácidos fracos são bastante utilizados por ter ação fixadora, juntamente com a ação descalcificante, fazendo ambos os processos.
       • Ácido Nítrico (HNO3)
         • Não causa inchaço dos tecidos, e proporciona maior nitidez nas colorações. Geralmente utilizado de 5% a 10% de concentração. Por ser um descalcificador muito prejudicial ao tecido, a exposição da amostra a tal solução não deve passar de 48 horas.
         • ÁCIDO NÍTRICO AQUOSO A 5% • Ácido nítrico: 5mL • Água destilada: 95mL
         • ÁCIDO NÍTRICO AQUOSO A 10% • Ácido nítrico: 10mL • Água destilada: 90mL
         • FORMALINA – ÁCIDO NÍTRICO • Formaldeído: 10mL • Água destilada: 80mL • Ácido nítrico: 10mL
         • FLUIDO DE PERENYI • Ácido nítrico 10%: 40mL • Etanol absoluto: 30mL • Ácido crômico 0,5%: 30mL
       • Ácido Clorídrico (HCL)
         • É um ácido muito utilizado por sua rápida ação, e utilizado mais em soluções tampão, como por exemplo, sulfato de sódio a 5% ou 10%.
         • O ácido clorídrico é uma solução preparada dissolvendo cloreto de hidrogênio (HCL) em água (H2O), e podem ser preparados em várias concentrações, existindo vários precursores de ácido clorídrico.
       • Ácido Fórmico (HCOOH)
         • Geralmente utilizado em soluções tampão citrato de sódio, tendo uma melhor coloração comparado ao método com ácido nítrico
         • ÁCIDO FÓRMICO A 5% • Ácido fórmico a 90%: 5mL • Água destilada: 95mL
         • FORMALINA – ÁCIDO FÓRMICO • Ácido fórmico 90%: 10mL • Formaldeído comercial: 5mL • Água destilada: 85mL
       • ÁCIDO FÓRMICO-CLORÍDRICO
         • Solução A – ácido clorídrico 8%: • Ácido clorídrico concentrado: 40mL • Água destilada: 460mL
         • Solução B – ácido fórmico 8%: • Ácido fórmico: 40mL • Água destilada: 460mL
       • Ácido Pícrico (C6H2(NO2)3OH)
         • Age de forma lenta, utilizado mais em solução aquosa saturada para descalcificação de tecido embrionário, após a utilização os tecidos devem ser lavados em álcool 70%.
     • RESINA DE TROCA IÔNICA.
       • Contém uma qualidade melhor que a descalcificação por ácido, já que ela promove rapidez, com boa preservação das células, usando a troca iônica entre o ácido fórmico e os fosfatos ou carbonatos.
         • RESINA • Win 3000 (resina de troca iônica): 100g • Ácido fórmico em solução aquosa a 10%: 800mL
     • MÉTODOS HISTOQUÍMICOS
       • São métodos utilizados para preservação enzimática, e de ácidos nucleicos e polissacarídeos, algo que a descalcificação por ácidos não permite. Incluem 2 métodos: mistura de tampões, e agentes quelantes.
     • AGENTES QUELANTES
       • O principal agente usado é o EDTA (ácido etilenediaminetetracético), ele inativa a fosfatase alcalina (enzima encontrada na maioria dos tecidos do corpo, com maior concentração em fígado e ossos), é um método lento, porém preservando a coloração, diferentemente da descalcificação por ácidos.

5. Coloração

   • O uso de corantes é essencial para análise das amostras, já que após os processos já feitos (principalmente a clarificação) o material apresenta transparência, e o corante auxilia na visualização das estruturas teciduais. Os corantes mais utilizados em amostras anteriormente fixadas são corantes não vitais: hematoxilina, eosina, fucsina etc.
   • TIPOS DE CORANTES
     • Corantes Ácidos
       • Possuem auxocromo aniônico (carga negativa (-)), com afinidade ao tecido catiônico (+). Ao serem coradas por corante ácido, as amostras são chamadas de acidófilas, temos o citoplasma como exemplo de material acidófilo.
         • Exemplo de corante: eosina
     • Corantes Básicos
       • Possuem auxocromo catiônico (carga positiva (+)), com afinidade ao tecido aniônico (-). Ao serem coradas por conte básico, são chamadas de basófilas, como o núcleo.
     • Técnica da Hematoxilina Eosina
       • O prazo de envelhecimento desta solução é entre dois e três meses. A partir essa data o corante perde suas propriedades e não reage de forma adequada.
       • Os materiais necessários para tal coloração são: • Hematoxilina: 2,5g • Álcool 100%: 25mL • Alúmen de amônio ou potássio: 50g • Óxido vermelho de mercúrio: 1,25g • Ácido acético: 20mL
   • A montagem final da lâmina consiste em depositar uma gota de resina líquida sobre, o corte que está aderido à lâmina de vidro e cobri-lo com uma lamínula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que se formam na resina durante a colocação da lamínula. Finalmente a lâmina é catalogada.

6. Processamento

   • Contém etapas de desidratação, clarificação ou diafanização, e impregnação em parafina, preparando a amostra que será, posteriormente, emblocada em parafina, ou em produtos similares
   • DESIDRATAÇÃO
     • Processo de remoção de água dos tecidos, para inclusão de parafina, já as substâncias não se combinam homogeneamente com a água. Um método muito empregado é a utilização de álcool etílico. Porém podem ser usados outros tipos de métodos.
   • CLARIFICAÇÃO OU DIAFANIZAÇÃO
     • Como citado anteriormente, a parafina não se combina com água, e atipicamente com álcool. Então para remover o álcool do material para o processo de penetração da parafina, é utilizado o xilol, em substituição do álcool.
   • IMPREGNAÇÃO
     • Ocorre a infiltração de substâncias como parafina, resina, ágar, gelatina, parafina plástica, goma arábica, polietileno glicol, parafina esterificada e celoidina, em função de tornar a amostra mais rígida ao ponto de ser possível a realização de cortes finos.

7. Inclusão

   • Ainda depois dos processos de fixação e desidratação, a amostra ainda contém muita fragilidade, e para melhorar e endurecer a amostra, ocorre a impregnação, feita normalmente por parafina.
     • A parafina é a mais utilizada por ter ação rápida e eficaz.
   • Durante todos os processos é utilizado cassetes histológicos, inclusive na inclusão. Os cassetes possibilitam o registro de número do material ajudando na identificação, e são importantes para microtomia, pois podem ser adaptáveis ao micrótomo.

8. Microtomia

   • É utilizado o micrótomo, em função de obter cortes delgados, sucessivo e uniformes, com melhor acabamento, a partir dos blocos de parafina. No micrótomo contém uma lâmina (fixada ou removível para descarte) de aço demasiadamente afiada, e um local que se prende o bloco para deslocamento vertical, chamado braço.
   • TÉCNICA DE CRIOMICROTOMIA
     • Nos micrótomos de congelamento os tecidos são congelados tanto fixados quanto frescos, causando o endurecimento do material. Acaba por ser a técnica mais utilizada entre as análises, todavia, não indicada para estudo de distribuição de lipídeos, ou cortes urgentes como exames patológicos.
     • Igualmente ao micrótomo de parafina, o micrótomo de congelamento contém uma navalha, porém cortam acima de 10 micrômetros.