Extracción de RNA

Extracción de RNA

1. Técnica de Trizol

   • 1. Homogenización
     • En un tubo Eppendorf de 1.5 mL, homogenizar la pellet (muestra) con 1 mL de reactivo Trizol. Cuando se ocupe mezclar suavemente con micro pipeta.
     • 2. Fase de separación
       • Incubar la muestra homogenizada durante 15 minutos a temperatura ambiente
         • Adicional 200ul de cloroformo, tapar perfectamente el tubo
           • Agitar x 15 segundos con fuerza
             • Incubar por 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y en posición vertical
               • Centrifugar las muestras a 14000rpm por 10 minutos, después la mezcla se separa en una fase inferior roja, fase de fenol cloroformo, en una interfase y en una fase incolora superior, la cual contiene exclusivamente el ARN
       • 3. Fase de precipitación
         • Transferir la fase acuosa cuidadosamente a un tubo Eppendorf nuevo
           • Adicionar 0.5 mL de isopropanol para precipitar el RNA
             • Incubar el tubo x 10 min a T amb y en posición vertical
               • Centrifugar a 10000 rpm por 10 min
         • 4. Fase de lavado
           • Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo
             • Adicionar 1 mL de EtOH al 75% al pellet para la varlo
               • Mezclar por agitacipon
                 • Centrifugar a 6000 rpm por 5 min
                   • Eliminar el sobranadante
           • 5. Fase de disolución
             • Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una toalla de papel estéril
               • Adicionar 30 microL de agua libre de RNAsa
                 • Disolver el RNA por pipeteo suave, opcionalmente incubar por 10 min a 55-60°C