INMUNODETECCION

INMUNODETECCION

1. FUNCIONA_Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su peso molecular • A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés • El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad relativa en la muestra

2. 1- PREPARACION DE LA MUESTRA

   • 1_Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas
   • 2_Determinar la concentración de proteínas
   • 3_Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas (dímeros, estructuras terciarias)

3. 2.Electroforesis con un gel

   • El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampón de migración. Un tampón de migración suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3 • Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 µg por calle • Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas hacia el polo positivo • Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas SDS-PAGE funciona? endógenas de las mismas son despreciables • El resultado es que las proteínas se separan en función de su talla, o peso molecular • Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del gel y por tanto migran mas rápidamente

4. 3. transferencai gel- membrana

   • El principio es similar al de PAGE, es decir, las proteínas cargadas negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo eléctrico Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición que en el gel 17 Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF). Estas últimas requieren un pretratamiento con metanol

5. 4. inmunodeteccion

   • Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo Sustrato (peróxido de hidrógeno + luminol) Producto (sensible a la luz) Los sustratos cromogénicos (4-cloronaftol o DAB) también pueden utilizarse con las enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la membrana próximo a la zona del anticuerpo Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una señal que se captura en una película fotográfica Los anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos también pueden usarse siempre y cuando se disponga de un equipo de detección especia
     • DETECCION DIRECTA : DETECCION DE ANTIGENO DETECCION INDIRECTA: DE ANTICUERPO

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