ácido clavulânico

ácido clavulânico

1. Características

   • composto modulador do SNC
     • permeabilidade excepcional à barreira hematoencefálica
     • atividade antidepressiva
   • suprime a ansiedade e melhora as funções sexuais
     • Teste em roedores e primatas

2. Mecanismo de ação

   • modulação SNC
     • mecanismo detalhado de ação ainda não elucidado

3. Artigo

   • Objetivo
     • examinar melhor seu potencial como agente modulador do SNC
     • examinar melhor seu mecanismo de ação
     • investigamos os efeitos do ácido clavulânico em duas linhas celulares de neurônios dopaminérgicos
   • investiga os efeitos do ácido clavulânico em células neuronais

4. Resultados do estudo

   • indicam que o ácido clavulânico aumenta a liberação de dopamina em células PC12 e SH-SY5Y sem afetar a síntese de dopamina.
   • Usou
     • cromatografia de afinidade
       • identificou duas proteínas, Munc18-1 e Rab4
         • Munc18-1
           • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20681955
             • https://www.nature.com/articles/ncomms9852
               • A fusão de vesículas sinápticas repletas de neurotransmissores com a membrana plasmática requer duas classes de moléculas - o receptor SNAP (SNARE) e a proteína Sec1 / Munc18 (SM). Estudos de reconstituição sugerem que a proteína SM Munc18-1 promove o zíper de complexos trans-SNARE e acelera a cinética da fusão de membrana dependente de SNARE
                 • Mecanismo dde zíper se entrelaçam alfa hélices do v snare e tsnare
                   • A proteína do sintax1
                     • Um knockout de Munc18 causa ausencia de exocitose, assim bloqueia a neurotransmissao
                 • Munc18-1
                   • Nos neurônios, a deleção da proteína sináptica Munc18-1 elimina a liberação espontânea e evocada de neurotransmissores
                   • Munc18-1 promove o zíper de complexos trans-SNARE e acelera a cinética das reações de fusão dependentes do SNARE
                     • as proteínas SNARE e Munc18-1 catalisam a reação de fusão da secreção vesícula com a membrana plasmática.
                   • A fusão começa quando o v-SNARE com raízes vesiculares emparelha-se com os t-SNAREs ancorados na membrana-alvo para formar um complexo trans-SNARE
                   • O complexo trans-SNARE fecha progressivamente em direção aos domínios proximais à membrana
         • Rab4
           • Rab4
             • As proteínas Rabs pertencem à família de pequenas GTPases, com funções de tráfego de vesículas e organelas,
               • A reciclagem de vesículas desempenha um papel fundamental mantendo a homeostase após a exocitose da vesícula. Existem vários mecanismos para sinápticos reciclagem de vesículas, incluindo exocitose rápida / endocitose e endocitose mediada por clatrina. Independentemente do mecanismo de endocitose, todas as vesículas recicladas são carregadas com neurotransmissores antes da fusão subseqüente [11]. Os endossomas iniciais demonstraram contêm domínios para Rab4 e Rab5 que estão envolvidos na fusão endossómica e endocítica reciclando. Endossomos reciclados contêm domínios para Rab4 e Rab11, que são necessários para o tráfego de vesículas desde o endossoma inicial até a membrana plasmática [23].
             • Regula a reciclagem endocítica rápida e lenta
             • As Rab participam do processo de identificação das vesículas.
             • Especificidade
             • Aprisionamento
               • Ancoragem
             • Na superfície das vesículas são reconhecidas pelas proteínas de aprisionamento na superfície citosólica da membrana alvo
         • potencialmente se ligam ao ácido clavulânico e desempenham um papel crítico na neurossecreção e no processo de tráfico vesicular.
   • em células tratadas com ácido clavulânico
     • houve aumento na translocação de Munc18-1 e O Rab4 do citoplasma para a membrana plasmática

5. Ansiedade

   • Hipótese da monoamina
     • desequilíbrio ou a deficiência de neurotransmissores de
       • monoamina
         • dopamina
         • serotonina
         • norepinefrina
     • Medicamentos
       • inibidores da monoamina oxidase
       • antidepressivos tricíclicos
       • Benzodiazepínicos
         • Aumentam o efeito de uma substância química cerebral chamada GABA (ácido gama- aminobutírico). GABA é um inibidor cerebral produzido no cerebelo, nos gânglios basais e em muitas áreas da medula espinhal. A sua função é relaxar e reduzir a atividade dos neurônios.
     • todos os tratamentos químicos e não-químicosa umentam a dopamina no córtex frontal e outras áreas do cérebro
       • Revisão bibliográfica de Lavergne et al
   • Ácido clavulânico
     • Atividade antibacteriana
     • forte efeitos moduladores do SNC
       • Estudos recentes
       • Diminui a ansiedade em roedores e primatas
     • facilmente atravessa a barreira hematoencefálica (BHE)
       • molécula pequena que passa pela BHE melhor que as outras moléculas pequenas
     • A proporção de ácido clavulânico entre o líquido cefalorraquidiano humano e o plasma é de 0,25, sugerindo nível consideravelmente mais alto de penetração cerebral do que a maioria das outras pequenas moléculas
       • resumindo, é uma molécula peq que passa pe BHE melhor que as outras mol peq
   • Artigo
     • investigamos os efeitos do ácido clavulânico em duas linhas celulares de neurônios dopaminérgicos
       • Os dados sugerem que o ácido clavulânico aumenta os níveis de dopamina em ambas as células neurônais
         • Propomos que o aumento da dopamina pode ser através de um mecanismo envolvendo tráfico de vesículas e fusão através da ligação e regulação de Munc18-1 e Rab4.

6. Materiais e métodos

   • determinação da dopamina
     • Células foram tratados com 100 μM de ácido clavulânico por 6 e 12 h
     • Após o tratamento, as células foram colhida e lisada imediatamente
     • centrifugadas a 10.000g por 20 min a 4 ° C
     • sobrenadante foi usado para medir a dopamina
   • Determinação da concentrações de proteína
     • células foram tratadas com 100 μM de ácido clavulânico por 6 e 12 h e estimuladas
     • com 50 mM [Milimolar] de solução de K + para despolarização
     • nível de dopamina medido imediatamente
     • proteínas identificadas foram verificadas por Western blotting com Munc18-1 ou Anticorpo Rab4
   • Microscopia confocal
     • Para imunofluorescência
       • células SH-SY5Y diferenciadas foram cultivadas em lamínulas
       • fixadas por 30 min usando paraformaldeído a 4%
       • As células fixas foram incubadas com o anticorpo Munc18-1 ou Rab4
     • Imagens confocais foram coletadas usando um laser MRC 1024-criptônio / argônio confocal de varredura equipado com um fotomicroscópio Zeiss LSM 510 Meta.
   • Cromatografia de afinidade
     • Cromatografia de afinidade é uma técnica que utiliza propriedades físico­químicas para separação dos componentes de uma mistura, a partir da distribuição destes em duas fases uma móvel e outra estacionária que se encontram em íntimo contato. Durante a passagem da fase móvel (extrato protéico) pela fase estacionária (sephadex G ­50), os componentes da mistura são distribuídos de modo que deles são seletivamente retidos na fase estacionária (apresentam afinidade pela fase estacionária), enquanto outros migram de forma diferenciada. Para a separação de uma proteína em particular, é introduzida uma substância que se liga à fase estacionaria removendo­a da coluna.
     • Fase móvel
     • Fase estacionária
       • componentes da mistura são distribuídos de modo que deles são seletivamente retidos na fase estacionária
         • apresentam afinidade pela fase estacionária

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