TÉCNICAS BIOLOGÍA MOLECULAR

TÉCNICAS BIOLOGÍA MOLECULAR

1. PCR: técnica de clonación molecular para una amplificación selectiva de un fragmente de DNA a partir de una cantidad mínima de muestras

   • PASOS
     • DESNATURALIZACIÓN (90º - 30/60s) = se desenrollan las hebras para que pueda acceder la polimerasa
     • HIBRIDACIÓN (45/60º - 30/60s) = se crean unos oligonucleotidos que actúanos como primer
     • EXTENSION (72º - 1Kb/min) = se van sintetizando los nucleotidos
   • PCR anidada: se realizan dos PCR seguidas, los 2 oligonucleotidos híbrida dentro de la secuencia
     • ventajas
       • perfecto para fragmentos de DNA poco abundante
       • menos probabilidad de inespecificaciones, mas ciclos
     • aplicación
       • detectar parasitos en sangre cuando aun no hay niveles altos
   • PCR multiplex: permite amplificar varios fragmentos de DNA a la vez
     • ventajas
       • más económico y rápido
     • aplicaciones
       • detección de patógenos
       • DNA satélite
       • detección de mutaciones
   • PCR cuantitativa: permite ir monopolizando la PCR segunde realiz, DNA con fluorocromos cuya fluorescencia se puede monopolizar
     • fluorescencia proporcional a la cantidad de DNA amplificado
       • podemos conocer la cantidad de DNA
     • Cq ó Ct (ciclo de fluorescencia): menor Ct = antes se detecta la fluorescencia = mayor cantidad de DNA
     • fluorocromos
       • SybrGreen: agente intercalante verde
       • TaqMan: un fluoroforo reporter y uno quencher
       • molecular beacon: sondas de horquilla, emiten al unirse al amplicon

2. ELECTROFORESIS: técnica de visualización y análisis de los productos de una reacción

   • PROCESO
     • Separación electroforética en un gel de agarras teñidos con un agente intercalaste
     • Agarosa frena la migración
       • mayor PM = menos migra
       • menos compactado = mas migra
     • agentes intercalantes
       • bromuro de etidio = tóxico, fluorescencia naranja con rad UV
       • Sybrsafe y Redsafe = menos tóxico

3. SECUENCIACIÓN: sirve para determinar la secuencia de nucleótidos del DNA

   • METODO sANGER / DIDEOXINUCLEÓTIDS: se basa en la actividad de la DNA polimerasa
     • pasos
       • 4 reacciones con los cuatro ddNTP
       • en cada reacción una molécula radiactiva (las cadenas están marcadas)
       • se va polimerizando hasta que aparece un ddNTP que para la reacción
       • síntesis de fragmentos de distinta longitud
       • electrophoresis en gel de poliacrilamida, cada reacción en una carril
       • los fragmentos cortos son los que mas migran y llegan al final
       • se lee de abajo hacia arriba
   • SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA: sustituye radiación por fluorescencia
     • pasos
       • cada ddNTP esta marcado con un fluorocromo distinto
       • solo se hace 1 reacciones en vez de 4
       • electroforesis capilar
       • detector: para determinar el nucleotido incorporado
       • ELECTROFORETOGRAMA
   • SECUENCIACIÓN MASIVA O NGS (Next Generation Sequencing): secuenciación del genoma completo basado en secuencia fragmento de DNA de forma simultánea
     • illumina (solexa)
       • pasos
         • DNA se fragmenta
         • PCR de cada fragmento
         • secuenciacion con fluorescencia
         • terminado: solo permite incorporar un nucleotido por ronda
         • terminador se elimina
         • ordenación de fragmentos

4. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: tecnología de DNA recombinante

   • EXONUCLEASAS
   • ENDONUCLEASAS
     • ENDONUCLEASAS DE REESTRICCIÓN: cortan el DNA en secuencias específicas y crean extremos cohesivos o romos que permiten la union de fragmentos diferentes de DNA
       • sitios de reestricción: 4-8pb palindrómicas
       • enzimas de restricción: se nombran con tres letras (la primera en mayúscula) y un número
   • MAPAS DE REESTRICCIÓN: DETERMINA LA ESTRUCTURA DEL dna
     • DNA digerido con enzimas de reestricción
       • se determina la localización de cada secuencia de restricción

5. SOUTHERN BLOT: localización y análisis de un fragmento de DNA

   • pasos
     • DNA se digiere con enzimas de reestricción
       • DNA fragmentado
         • electrophoresis
           • dsDNA se desnaturaliza a ssDNA con NaOH y neutraliza
             • DNA a una membrana de nitrocelulosa
               • incubación del DNA marcado
                 • película autorradiográfica

6. CLONACIÓN: Colección de moléculas o de células idénticas a una molécula de DNA original

   • vectores de clonación: moléculas de dsDNA circular exocromosomico con capacidad autoreplicativa
     • COMPONENTES
       • Origen de replicación
         • marcador de selección: gen de resistencia aun antibiótico
           • sitio de inserción: donde se va insertar con un `lugar múltiple de reestricción`con sitios de reestricción para que se pueda digerir con mas de una enzima de reestricción
     • PLASMIDO
     • PASOS
       • DNA purificado = sin intrones
       • DNA se corta con enzimas de reestricción
       • DNA # Plasmado
       • se introduce en la célula
       • aislamiento de clones positivos