PRUEBA DE REDUCCION NBT

PRUEBA DE REDUCCION NBT

1. FUNDAMENTO

   • Se han identificado al menos 5 componentes de la oxidasa. Dos unidos a la membrana plasmática y tres citosólicos, los cuales se ensamblan tras la activación celular para dar inicio a la actividad oxidativa característica de los fagocitos produciendo ROS. Un método simple y útil para evaluar el "estallido respiratorio" post-activación, es la prueba de reducción del NBT (Nitro Blue Tetrazolium
     • este ensayo es una prueba indirecta utilizada para evaluar desórdenes de la fagocitosis y del sistema bactericida dependiente del oxígeno, es la prueba estándar para la detección de la EGC, debido a que las células de las personas que sufren este mal dan la reacción alterada o no la dan del todo. precipita en forma de cristales insolubles de color azul muy intenso, casi negro, debido a la producción de cristales de formazán.obtenido utilizando hidróxido de potasio (KOH) y dimetil sulfóxido (DMSO), presume de aumentar la sensibilidad del ensayo

2. METODOLOGIA

   • MICROMETODO EN SANGRE TOTAL
     • 1. Obtener 0,3-0,4 mL de sangre heparinizada (10-50 U/mL).
     • 2. En un tubo eppendorf, mezclar 500 μL de sangre o idealmente Buffy coat (capa de leucocitos) y realizar un extendido de sangre para teñir como control basal (tinción de Wright).
     • 3. Adicionar agente estimulante policlonal PMA a las distintas tres concentraciones requeridas 10, 20 y 30ng/mL (tres preparaciones por muestra); incluir un control negativo interno (muestra sin estímulo).Incubar por 20 min a temperatura ambiente
     • 4. Agregar 100 μL de solución de NBT al 0,1% en PBS e incubar por 15 min a 37°C, en la oscuridad.
     • 5. Preparar una extensión gruesa de cada tubo y teñir con colorante de Wright (1 min en colorante y 3 min cubierto con agua). Contar los polimorfonucleares neutrófilos positivos (presencia de precipitado azul oscuro intenso) y negativos (ausencia de precipitado)
     • VALORES DE REFERENCIA
       • Leucocitos no-estimulados (sin PMA): 0-10% de positividad
       • Leucocitos estimulados con PMA: 40-90% de positividad
   • MICROMETODO EN SANGRE TOTAL Y ESTIMULACION CON PMA
     • 1. Tomar 2 portaobjetos y colocar en cada uno una gota grande de sangre total, (anticoagulada con heparina, EDTA o citrato). Colocar en cámara húmeda e incubar por 30 min a 37°C, con 5-7% de CO2 (incubadora de cultivo celular).
     • 2. Lavar muy suavemente las células no adheridas, con PBS, colocar de nuevo en la cámara húmeda y cubrir cada portaobjeto con la solución de NBT correspondiente (NBT con éster de forbol [NBT/PMA] y NBT solo). Incubar por 15 min a 37°C.
     • 3. Lavar muy suavemente con PBS y secar al aire.
     • 4. Teñir con safranina al 1% en agua por 2 min, lavar con agua destilada y secar al aire.
     • 5. Examinar 100 células al microscopio y determinar el porcentaje que redujo el NBT.
     • VALORES DE REFERENCIA
       • Leucocitos no-estimulados (sin PMA): <5% de positividad
       • Leucocitos estimulados con PMA: >90% de positividad.

3. INTERPRETACION

   • En consecuencia, la ausencia de reducción del NBT (<10% de células positivas) en leucocitos que han sido estimulados por LPS o PMA, indica que existe un defecto metabólico importante, usualmente asociado con la enfermedad granulomatosa crónica (EGC), ya que la falla del colorante se asocia a esta enfermedad, por lo tanto los neutrofilos de estos pacientes nos pueden fagocitar ciertos microorganismos intercelulares. Caracterizada por el defecto de la capacidad oxidativa de fagocitos. Dado que esta enfermedad frecuentemente puede hallarse ligada al cromosoma X. y alterar todo su estado normal de su sistema.
   • En individuos normales, cuando se estimula a los fagocitos con lipopolisacáridos ( LPS ) bacterianos u otros agentes como el Forbol Miristato Acetato ( PMA ), se observa que la gran mayoría de las células ( > 90% ) reducen el NBT, generando formazán ( color azul oscuro ). A mayor número de células coloreadas, significa que las celulas estan en la capacidad de destruir bacterias y protejerse a infecciones microbicida al paciente. Por lo cual tiene mayor posibilidad de fagocitar a los patogenos, esta tecnica tiene intervalos de referencia que varian entre 80% y 100%.

4. IMPORTANCIA

   • Porque ayuda a evaluar la capacidad metabólica de los fagocitos humanos mediante la demostración de su potencial citotóxico , consecuencia del estallido respiratorio.

5. MUCHAS GRACIAS

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