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1. Processo Downstream

   • Visa a recuperação e a pureza da biomolécula de interesse
     • Para biofármacos é requerido alto grau de pureza
       • Em especial para os de administração parenteral
     • Cada biomolécula possui uma estrategia de recuperação e purifificação diferente
       • Essa estrategia deve ser estudada em varias escalas para obter o processo mais eficiente
       • Para desenvolver essa estrategia devem ser considerados
         • As características da proteína
         • O sistema de expressão
         • Os componentes do meio de cultivo
         • As principais impurezas que devem ser eliminadas
         • O uso final da biomolécula que define a pureza exigida
       • Pontos em comum
         • Usar métodos baseados em princípios físicos diferentes e que explorem as diferenças entre os compostos
         • Projetar etapa mais cara para o final
         • Remover os contaminantes menos relacionados ao produto e de maior quantidade mais cedo possível
   • Começa pela obtenção do volume celular contido do biorreator
     • Separação sólido-líquido ou Clarificação
       • Produto é intracelular
         • Células que não secretam as proteínas
         • Rompimento celular
           • Objetivo: lise celular para liberar a proteína
           • Principais Operações Unitárias
             • Principio: cisalhamento
               • Homogeneização
               • Ultrassom
               • Moagem em moinho de bolha
             • Rompimento químico ou enzimático
               • Por meio da hidrolise, desidratação ou desidratação de componentes da parede ou membrana celular
           • Separação sólido-líquido
             • Meio líquido clarificado
               • Recuperação
             • Objetivo: Remover debris celulares e obter o sobrenadante
       • Recuperação inicial que separa células do meio líquido (sobrenadante)
       • Produto extracelular
         • Usa o liquido clarificado (sobrenadante)
           • Recuperação inicial / Isolamento Primário
             • Purificação intermediaria
               • Purificação Final / Polimento
                 • Objetivo: Eliminar contaminantes específicos, agregados e variantes
                 • Principais Operações Unitárias
                   • Etapas cromatográficas
                     • Usa a cromatografia preparativa que visa isolar o produto para depois utiliza-lo .
                 • Durante esses processos devem ser feitos Filtrações esterelizantes
                   • Devido ao risco de contaminações virais
                     • Podem ser eliminados por
                       • Remoção
                         • Por meio de separação física viral
                           • Como na Nanofiltração
                       • Inativação
                         • Por meio de métodos químicos que causam a morte ou modificação viral
                           • Usando detergentes ou pH baixo
                 • Formulação / Envase
             • Objetivo: Remoção de contaminantes com características diferentes da proteína alvo
             • Principais Operações Unitárias
               • Etapas cromatográficas
                 • Que podem ser
                   • Cromatografia Liquida
                     • Separação de moléculas entre duas fases imiscíveis
                       • Fase móvel: liquida
                       • Fase estacionária : gel / sólida
                   • Cromatografia por troca iônica
                     • Catiônica
                       • Fase estacionária com carga positiva e adsorvem proteínas com carga negativa
                     • Aniônica
                       • Fase estacionária com carga negativa e adsorvem proteínas com carga positiva
                     • Separação dependente do pH e do isoeletrico (PI)
                   • Cromatografia por afinidade
                     • Separação ocorre por meio de interações altamente especificas
                       • Entre ligante imobilizado na fase móvel e a molécula alvo
                   • Cromatografia por exclusão molecular
                     • Separação de acordo com peso molecular, forma e tamanho
                   • Cromatografia de interação hidrofóbica
                     • Separação com base na hidrofobicidade da molécula de interesse
               • Filtração
                 • Separação a partir do tamanho das moléculas em função do tamanho dos poros
                   • Microfiltração
                     • Diâmetro: 0,1 a 10 ?m
                       • Útil para esterilização bacteriana
                   • Ultrafiltração
                     • Diâmetro: 1 a 100 nm com Macromoléculas acima de 5000 Da
                       • Útil para concentrar macromoléculas e fazer a troca de tampão
                   • Nanofiltração
                     • Para moléculas entre 300 e 2000 Da
                       • Útil para concentrar macromoléculas e fazer a troca de tampão
                         • E para remoção viral
                   • Diafiltração
                     • Útil para troca de solvente
         • Células animais secretam as proteínas
       • Principais Operações unitárias
         • Com base no tamanho das partículas
           • Filtração Convencional
             • Alimentação da suspensão celular é perpendicular ao meio filtrado
             • Tem uma aplicação de pressão e elevada resistência à filtração pela deposição de células
           • Filtração Tangencial
             • Alimentação da suspensão celular é paralelamente ao meio filtrado
             • Tem uma aplicação de pressão e sem deposição de células
         • Com base no tamanho e densidade das partículas
           • Centrifugação
             • Estabelece um campo gravitacional centrífugo
             • Sedimentação dos sólidos com maior densidade do que o liquido