Processo produtivo de Biofármacos

Processo produtivo de Biofármacos

1. A partir do clone mais produtivo

   • Bancos celulares são desenvolvidos em ambientes com boas práticas de fabricação
     • Banco de células mestre (BCM)
       • Consiste em alíquotas elaboradas a partir de um clone de células selecionadas sob condições definidas, e armazenadas em temperaturas abaixo de -100°C
       • Banco de células de trabalho (BCT)
         • Produzido a partir de alíquotas do BCM
           • Número de tubos corresponde ao planejamento de produção dos lotes
             • Quantidade de alíquotas que compõe o BCT depende
               • Forma do processo produtivo de determinado medicamento
               • Tempo esperado para que o medicamento seja vendido
         • Armazenamento dos bancos celulares
           • As células devem ter as mesmas características quando forem ser utilizadas
             • Processo de congelamento
               • Evitando mudanças ou alterações celulares
                 • 1ª
                   • Upstream
                     • Crescimento microbiano ou cultivo celular que permite a produção da biomolécula alvo.
                       • Modos de operação
                         • Influencia consideravelmente a eficiência do cultivo
                         • Batelada ou descontínuo
                           • São adicionados no biorreator no início da etapa
                             • Todo o volume de meio de cultivo e a quantidade de substratos necessários ao crescimento celular e à síntese do produto
                               • Adiciona-se somente
                                 • Oxigênio
                                 • Antiespumante
                                   • A agitação gera uma espuma
                                 • Ácido ou base para controle do pH
                           • Acúmulo de impurezas e de molécula-alvo
                             • Esgotamento de nutrientes
                               • Células não conseguem se replicar de forma eficiente
                                 • Limitação da produtividade
                           • Processo usado em etapas iniciais e em laboratórios para verificar a produção da proteína recombinante
                             • Ineficaz em outras escalas
                           • Comum em indústrias alimentícias
                         • Batelada alimentada
                           • Amplamente usado nas indústrias biofarmacêuticas
                           • Durante o processo adicionam-se nutrientes essenciais para o crescimento celular e/ou para a síntese do produto alvo
                             • Cultivo dura mais
                               • Maior densidade celular
                                 • Melhor produtividade da biomolécula-alvo
                             • Os nutrientes são inseridos em uma solução concentrada
                               • Para que o volume não seja significativamente alterado
                             • O produto e as impurezas se acumulam no meio
                               • Limitação da produtividade
                         • Contínuo
                           • Não sofre interrupções ao longo do tempo
                             • Alimentação contínua de meio de cultura no biorreator e por uma correspondente retirada contínua de meio cultivado
                               • Condições no interior do biorreator permanecem constantes ao longo do tempo
                                 • Cultivo por longos períodos
                               • Substâncias tóxicas vão sendo retiradas através da saída do meio de cultivo
                           • Realizado sem ou com retenção de células
                             • Com retenção
                               • Perfusão
                                 • Células em suspensão são retidas por um dispositivo, como filtros
                                 • Meio de cultivo novo é adicionado, sai o meio cultivado com filtração das células
                                   • Possibilita altas densidades celulares
                                     • Alta produtividade
                                   • Limitações
                                     • Grandes volumes de meio de cultivo obtidos devem ser processados
                                       • Aumento dos gastos no processo Downstream
                             • Sem retenção
                               • Células retiradas junto com meio de cultivo
                         • Sistema híbrido
                           • É feita por alguns dias a perfusão
                             • Em seguida, altera-se a operação para o modo de batelada alimentada
                               • Maiores densidades celulares
                                 • Aumento da produtividade
                                   • Com o mesmo volume final de cultura que seria obtido com o processo de batelada alimentada tradicional
                                     • Volume menor a ser processado na etapa downstream
                     • Inicia-se com o descongelamento de uma ampola do Banco de Células de Trabalho
                       • Essas células são cultivadas em volumes crescentes nos biorreatores
                         • Gradualmente as células recuperam suas atividades metabólicas
                           • Quanto maior o volume nos biorreatores, maior a densidade celular
                             • O objetivo é alcançar a quantidade adequada de células, para que sejam inoculadas em um volume maior
                             • Biorreatores
                               • Sistemas fechados que permitem
                                 • Fornecer as condições adequadas para crescimento celular e formação do produto
                                   • Promovendo
                                     • Mistura e aeração homogêneas
                                     • Turbulência suficiente para transferência eficaz de calor
                                     • Dispersão adequada de ar e gás
                                     • Prevenção de segregação de substrato
                                     • Mensurabilidade das variáveis de processo dos principais parâmetros
                                     • Manutenção da estabilidade e da esterilidade no longo prazo
                                 • Fornecer um ambiente asséptico
                                   • Como o objetivo é a produção de um biofármaco, não se pode ter contaminação
                               • O termo fermentador caracteriza exclusivamente um biorreator operando com microorganismos
                               • Monitoramento e controle de vários parâmetros.
                                 • Aumentando a produtividade do bioprocesso
                                 • Evidenciando ações corretivas, no caso de alteração dos valores especificados
                                   • Sendo algumas ações corretivas automáticas
                                 • Parâmetros
                                   • pH
                                     • Deve ser capaz de adicionar ácido ou base para manter o equilíbrio do sistema
                                   • Temperatura
                                   • Velocidade de agitação
                                   • Concentração de substratos (ex.: glicose)
                                   • Concentração de metabólitos (ex.: ácido lático)
                                   • Pressão de O2
                                   • Pressão de CO2
                                     • Deve ser capaz de eliminar o excesso de CO2 produzido
                               • Tipos
                                 • Tanque agitado (Stirred-tank)
                                   • Promove agitação mecânica
                                     • Equipados com dispositivos de aeração
                                   • Facilidade de monitoramento e controle de escalonamento
                                   • Velocidade de rotação ideal deve ser suficiente para garantir a homogeneidade do sistema
                                     • Sem causar rompimento das células
                                 • Single use
                                   • As bolsas estéreis são descartadas
                                   • Diminuição nos custos de aquisição e manutenção
                                     • Visto que o meio de cultivo não vai entrar diretamente em contato com o aço inox, ele não precisa ser tão puro
                                     • Diminuição das etapas de limpeza e esterilização
                                       • Métodos que necessitam de validação
                                         • Altos custos
                                   • Redução dos riscos de contaminação cruzada
                                   • Desvantagens
                                     • Dificuldade no escalonamento
                                     • Dependência das empresas no fornecimento das bolsas descartáveis
                 • 2ª
                   • Downstream
                     • Tem como objetivo a obtenção da biomolécula de interesse com grau de pureza e formulação requeridas a partir do meio no qual ela foi produzida
                       • Para cada biomolécula/proteína-alvo/insumo farmacêutico ativo/biofármaco é necessária uma estratégia para isolamento e purificação
                         • Pontos a serem considerados para o desenvolvimento da estratégia
                           • Características da proteína
                           • Sistemas de expressão
                             • Exemplo: células de mamíferos
                               • Geralmente a proteína-alvo já é exportada para o meio de cultivo
                                 • Lise celular não é necessária
                           • Principais impurezas a serem eliminadas
                           • Componentes do meio de cultivo
                             • Exemplo: soro bovino
                               • Possui muita albumina, que é uma impureza
                                 • São necessárias estratégias para purificação
                           • Uso final da biomolécula alvo
                             • Biomoléculas
                             • Proteínas utilizadas para ensaios estruturais
                           • Pureza a ser considerada
                             • Para aplicações terapêuticas
                               • A pureza do produto é primordial
                             • Biofármacos
                         • Pontos comuns ao desenvolvimento de estratégia de recuperação e purificação
                           • Métodos de separação baseados em princípios físicos distintos
                             • Filtração
                             • Cromatografias baseadas em princípios diferentes
                               • Métodos diferentes: maior chance de eliminar as diferentes impurezas do meio
                           • Métodos que explorem as maiores diferenças entre a proteína-alvo e as impurezas
                             • Deve-se conhecer as principais impurezas e suas características para saber quais os melhores métodos de isolamento e purificação
                           • Remover os contaminantes menos relacionados ao produto ou presentes em maior quantidade o mais cedo possível
                             • Lipídeos, carboidratos, DNA
                               • Muito diferentes da proteína-alvo
                             • Depois se elimina os componentes estruturalmente mais similares ao produto
                           • Projetar a etapa mais dispendiosa para o final
                             • No meio de cultivo inicial se têm muito volume
                               • Nas etapas de recuperação e purificação o volume diminui
                                 • O volume aplicado na etapa dispendiosa é reduzido
                       • Pode atingir até 80% dos custos totais de produção
                     • Recuperação e purificação
                       • Extremamente importante
                         • Maioria dos biofármacos são utilizados via parenteral
                           • Requerindo um alto grau de pureza na produção
                             • Geralmente maior que 99%
                       • Esquema geral de purificação de produto biotecnológico
                         • Biorreator Meio cultivado
                           • Clarificação Separação sólido-líquido
                             • O meio que era turvo, clareia com a separação
                             • Produto intracelular
                               • Células
                                 • O produto é produzido e permanece dentro da célula
                               • Rompimento celular
                                 • Liberação da proteína de interesse e outras
                                 • Separação sólido-líquido
                                   • Objetiva a remoção dos debris celulares
                                   • Meio líquido clarificado/Sobrenadante
                                     • Presença de proteína-alvo
                                     • Recuperação/Isolamento primário
                                       • Aumenta a concentração da proteína-alvo
                                       • Purificação/Purificação intermediária
                                         • Objetivam eliminar impurezas que têm características físico-químicas bem diferentes da proteína-alvo
                                         • Polimento/Purificação final
                                           • Eliminação de produtos mais parecidos com a proteína-alvo
                                             • Proteínas semelhantes
                                             • Agregados da proteína
                                           • Formulação/Envase
                                             • Colocar a proteína em uma solução adequada para administração e estabilização da macromolécula
                               • Etapas adicionais são necessárias para purificar
                             • Produto extracelular
                               • Meio líquido clarificado/Sobrenadante
                                 • O produto é produzido e secretado no meio
                                   • Menos complexo
                         • Principais tipos de operações unitárias utilizadas
                           • Na separação sólido-líquido Clarificação
                             • Filtração convencional
                               • A entrada da suspensão de células ocorre na direção perpendicular em relação ao meio filtrante
                               • Aplicação de pressão no meio alimentado
                               • Deposição contínua de células e meio sobre a membrana
                                 • Formação de torta de filtração
                                   • Gera elevada resistência à filtração
                             • Filtração tangencial
                               • A alimentação da suspensão de células ocorre na direção paralela em relação ao meio filtrante
                               • Aplicação de pressão no meio alimentado
                               • Escoamento tangencial minimiza o acúmulo de sólidos na superfície de membranas
                                 • Maior eficiência na filtração
                                   • Mais utilizado
                               • Também usado para separação de moléculas de tamanhos diferentes
                                 • Membranas com poros menores
                             • Centrifugação
                               • Estabelecimento de um campo gravitacional centrífugo
                               • Separação dos sólidos suspensos que apresentarem densidade maior que a densidade do líquido
                           • No rompimento celular
                             • Homogeneização
                               • Apresentam pistões, que aplicam altas pressões à suspensão celular forçando sua passagem através de um orifício estreito
                                 • Em seguida há colisão contra uma superfície em uma câmara sob baixa pressão
                                   • Queda de pressão + Impacto
                                     • Rompimento celular sem danificar proteínas
                                   • Separação sólido-líquido é necessária novamente para se obter o sobrenadante
                                 • Quando se trabalha com proteínas, esse sistema deve se manter em temperaturas mais baixas
                                 • Etapas devem ser adicionadas para evitar a contaminação por vírus
                                   • Principalmente nas células de mamíferos
                                   • Etapas de remoção devem ser validadas
                                   • Nas células bacterianas que possuem camada de lipossacarídeos
                                     • Endotoxinas
                           • A partir da obtenção do sobrenadante
                             • Filtração
                               • Permite a separação de elementos a partir de tamanhos
                               • Microfiltração
                                 • Visa esterilização bacteriana
                               • Ultrafiltração
                                 • Visa concentração de macromoléculas e troca de tampão
                               • Nanofiltração
                               • Diâmetro nominal de poro/Material retido
                                 • 1 a 100 nm Macromoléculas com massa molecular acima de 5000 Da
                                 • 0,1 a 10 µm
                                 • Moléculas de massa molecular entre 300 e 2000 Da
                               • Diafiltração
                                 • Aplicação de membranas para efetuar a troca de solvente de uma amostra
                             • Cromatografia
                               • Principais operações unitárias dos processos Downstream
                               • Cromatografia líquida
                                 • Separação das moléculas entre duas fases imiscíveis. A fase móvel/líquida e a fase estacionária/gel/sólida, contida em uma coluna cilíndrica
                               • Escala
                                 • Cromatografia analítica
                                   • Identificar e quantificar um determinado produto
                                 • Cromatografia preparativa
                                   • Recuperação e purificação de biofármacos
                                     • Isolar a proteína e utilizá-la em seguida
                               • Como ocorre?
                                 • Amostra contendo a proteína alvo é introduzida na coluna e transportada através desta pela fase móvel
                                   • A fase móvel é impelida pelo sistema cromatográfico por meio de bombas
                                   • As moléculas são retidas na matriz porosa da fase estacionária em função de fenômenos de adsorção, partição ou exclusão molecular
                                     • Remoção gradual das diferentes biomoléculas ocorre por ação de uma fase líquida eluente ou fase móvel
                                       • Migração diferencial dos elementos entre as duas fases
                                         • Separação dos diferentes componentes da amostra
                                           • Proteínas são identificadas com a incidência de radiação ultravioleta no comprimento de onda de 280 nm
                                             • Nas proteínas existem dois resíduos de aminoácidos que apresentam anéis aromáticos
                                               • Triptofano e tirosina
                                               • São capazes de absorver radiação a 280 nm
                               • Classificação
                                 • De acordo com o tipo de interação que ocorre entre as biomoléculas e a fase estacionária
                                   • Exclusão molecular
                                     • Separação das moléculas de acordo com o peso molecular, a forma e o tamanho
                                       • Moléculas maiores são as primeiras a deixarem a coluna, são excluídas da fase estacionária e são eluídas antes que as outras
                                       • Moléculas intermediárias podem apresentar penetração parcial na fase estacionária, entrando em alguns poros
                                       • Moléculas menores podem penetrar em todos os poros da matriz e se moverem lentamente ao longo da coluna, tendo acesso à fase móvel do interior dos poros e à existente entre as partículas
                                   • Troca iônica
                                     • Baseia-se na característica das proteínas de apresentarem cargas positivas ou negativas
                                       • Os resíduos de aminoácidos são carregados + ou -
                                         • A carga total de uma proteína é modulada pelo valor de pH do ambiente, associado ao ponto isolelétrico da respectiva macromolécula
                                       • Vai ocorrer a adsorção reversível de biomoléculas eletricamente carregadas a grupos com cargas opostas imobilizados em uma matriz sólida
                                         • As moléculas adsorvidas são eluídas por meio da variação da força iônica
                                           • Aumento da concentração salina promove maior competição , que reduz a interação entre os grupos da matriz e as biomoléculas
                                           • Ou pela variação do pH da fase móvel
                                             • Promove mudança na carga líquida total das proteínas
                                         • Cromatografia de troca aniônica
                                           • Matrizes são positivamente carregadas e adsorvem proteínas com carga negativa
                                         • Cromatografia de troca catiônica
                                           • Matrizes são negativamente carregadas e adsorvem proteínas com carga positiva
                                       • Diferentes graus de afinidade eletrostática entre a fase estacionária e os íons da fase móvel
                                         • Quanto maior a força iônica, maior a interação, maior a retenção
                               • Cromatografia de afinidade
                                 • Baseia-se na interação altamente específica entre um ligante imobilizado na fase estacionária e a molécula de interesse
                                   • Interação entre enzima e substrato antígeno e anticorpo
                                   • Ligante é imobilizado em um suporte insolúvel (matriz porosa) e o outro componente (proteína de interesse) é seletivamente adsorvido nesse ligante
                                     • A biomolécula alvo que for adsorvida pode ser eluída
                                       • Pela ação de ligantes que competem pelos sítios de ligação da fase estacionária ou da própria biomolécula
                                       • Por alterações nas condições da fase móvel que podem reduzir significativamente a afinidade
                                         • pH ou temperatura
                                   • Permite separar uma proteína a partir de uma amostra biológica complexa
                                   • Utilizada nas etapas iniciais do processo de recuperação e purificação
                                     • Ex.: afinidade da proteína A pela porção Fc de muitas imunoglobulinas de diferentes animais
                                       • Plataforma padrão para purificação em larga escala de anticorpos monoclonais para uso terapêutico
                               • Cromatografia de interação hidrofóbica
                                 • Baseia-se na interação de proteínas com cargas apolares presentes na matriz da coluna cromatográfica
                                   • Separação das proteínas de acordo com a hidrofobicidade das mesmas
                                     • Proteínas globulares
                                       • Em sua estrutura 3D, a maioria dos resíduos hidrofóbicos ficam no interior da proteína.
                                         • Protegidos por uma camada de solvatação da água
                                           • Uma proteína não interage com outra
                                             • Sem agregados
                                     • É necessária a exposição dos resíduos hidrofóbicos
                                       • Solução com alta concentração de sal NaCl
                                         • As moléculas de solvatação em solução de NaCl fazem a solvatação dos íons
                                           • Exposição dos resíduos hidrofóbicos
                                             • Começam a interagir com outros grupos
                                               • Interação com a matriz Interessante
                                                 • Depende da quantidade adequada de NaCl
                                                 • As proteínas que interagirem serão obtidas pela eluição
                                                   • Utiliza-se o gradiente decrescente de solução salina
                                                     • Proteínas menos hidrofóbicas são as primeiras a serem eluídas com a diminuição do sal
                                                     • Técnica de cromatografia muito utilizada após cromatografia de troca iônica, que tem maior concentração salina após eluição
                                               • Interação com outras mesmas moléculas
                                                 • Formação de agregados
                                                   • Possível alteração da estrutura Não interessante
                                                   • Concentração de proteínas
                             • Etapas adicionais
                               • Biofármacos que são proteínas não podem passar por um processo de esterilização por colar úmido
                                 • Pode ocorrer desnaturação e perda de função biológica
                               • Filtração esterilizante
                                 • Utilização de filtro estéril de tamanho de poro nominal de 0,22 µm ou menor
                                   • Bactérias (0,2 µm - 1,5 µm) e fungos são retidos
                                   • Vírus (0,02 µm - 0,4 µm)
                                     • Nem todos são retidos
                                     • Risco de contaminação viral
                                       • Existente em todos os produtos biológicos cuja produção envolve o uso de material de origem animal ou humana
                                       • Eliminação de vírus
                                         • Remoção
                                           • Separação física das partículas virais do fluxo líquido
                                             • Filtração Nanofiltração
                                           • Precisam ser validadas
                                             • É acrescentado no processo Downstream uma quantidade conhecida de vírus e é necessário através de ensaios que se prove que esses vírus tenham sido eliminados
                                         • Inativação
                                           • Morte ou a transformação dos contaminantes em não infecciosos do processo
                                             • Métodos químicos Detergentes, pH baixo ...
                                   • Micoplasmas (0,15 µm - 0,3 µm)
                                     • Infectam células de mamíferos
                               • Processo produtivo asséptico
                                 • Utilização de áreas limpas
                                   • Apropriado padrão de limpeza e receber ar que tenha passado por filtros de eficiência aprovada