Técnicas cromatográficas

Técnicas cromatográficas

1. Los procesos de separación de proteínas están principalmente dominadas por cromatografía de líquidos

   • La resolución de mezclas proteicas por CL se basa en el principio de que bajo un conjunto dado de condiciones, los solutos disueltos en una fase móvil interactúan en grado diferente con la fase estacionaria contenida en la columna.
     • Las técnicas cromatográficas han sido utilizadas en el análisis y purificación de proteínas; sin embargo, se han realizado diversos estudios en donde son usadas para detectar cambios conformacionales en las proteínas, ya sea por el proceso cromatográfico en si o por la naturaleza de la muestra.
       • Técnicas cromatográfıcas utilizadas en la separación de proteínas.
         • Cromatografía de exclusión molecular (SEC)
           • Separación de biomoleculas de acuerdo a su tamaño cuando una solución fluye a través de una cama empacada con un medio poroso.
             • El proceso de separación depende del tamaño y el volumen hidrodinámico, el cual define la capacidad de la molecula de penetrar o no en los poros de la fase estacionaria. Las moléculas grandes son excluidas de los poros debido a un efecto estérico y pasan rapidamente a través de la matriz.
               • Un amplio rango de matrices preparativas y analíticas está disponible. Las matrices preparativas mas usadas son frecuentemente de polímeros naturales. Las columnas de SEC de alto rendimiento son usadas analíticamente para estudiar la pureza de las proteínas, su plegamiento, las interacciones.
                 • En contraste con otros tipos de cromatografía, la selectividad de una matriz de SEC no se puede ajustar cambiando la composicion de la fase móvil. La SEC es frecuentemente utilizada como un paso de pulimiento final del producto.
         • Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
           • Esta cromatografía separa las moléculas con base a su carga iónica neta. La separación se lleva a cabo por la competencia entre proteínas con diferente carga superficial por grupos cargados opuestamentes que están sobreuna matriz de intercambio ionico.
             • En una separacion utilizando IEC, las interacciones hidrofóbicas reversibles entre los solutos son controladas con el objetivo de favorecer la union o elución de moléculas específicas logrando su separación.
               • De acuerdo a la carga que tiene la proteína (debido al pH y al pI) es al tipo de matriz que se va a unir; de ahí que existan intercambiadores aniónicos (matriz +) e intercambiadores catiónicos (matriz -).
                 • La elección de una matriz de intercambio iónico adecuada es uno de los aspectos mas importantes y debe estar basada en diversos factores: 1) Fuerza del intercambiador, 2) Flujo de la muestra, 3) Propiedades de la muestra.
                   • Los intercambiadores fuertes son por lo tanto utilizados en la optimizacion de los protocolos ´ de purificacion; los intercambiadores ionicos débiles son más flexibles en términos de selectividad, son comúnmente elegidos para la separación de proteínas que retienen su funcionalidad sobre un rango de pH de 6 a 9, así también como para purificar proteínas lábiles.
         • Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
           • HIC es uno de los metodos de purificación de macromoléculas biológicas más utilizado (proteínas terapéuticas).
             • La HIC explota la interacción reversible entre la superficie hidrofóbica de una proteína y una matriz cromatográfica con un ligando hidrofóbico a moderadamente altas concentraciones de sal.
               • La fase estacionaria (matriz) en HIC presenta pequenos grupos no-polares unidos a estructuras de polímeros hidrofílicos. ). El soporte por sí mismo debe ser inerte y no debe tener grupos funcionales capaces de ligarse a la proteína.
                 • La unión y/o elucion en HIC son logradas por la adición o remoción de sales u otros solutos. La estructura formada por las sales aumenta la fuerza de las interacciones hidrofóbicas. La elucion se lleva a cabo mediante la reducción de la concentracion de sal, ya sea a través de un gradiente o en forma escalonada.
         • Cromatografía de fase reversa (RPC)
           • Cromatografía en la cual la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil. La RPC es una técnica de purificación capaz de separar componentes con características muy similares.
             • Fase estacionaria. Hay dos tipos principales de medios para RPC, uno basado en una matriz hidrofílica de perlas de sílice cubierta con una fase hidrofóbica unidos por cadenas de carbono y otro basado en una matriz de polímero hidrofóbico. La porosidad de la fase estacionaria es un factor crucial y determinante en la adsorción
               • Fase movil. La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse anadiendo un disolvente orgánico a la fase móvil acuosa. Al disminuir la polaridad de la fase móvil, la distribución de los solutos cambia hacia la fase móvil.