PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VITRO

PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VITRO

1. diseñadas para determinar la reactividad biológica de cultivos de células de mamíferos

   • después de entrar en contacto con plásticos elastoméricos y otros materiales poliméricos.
     • están en contacto directo o indirecto con el paciente
   • Cuando ésta no se puede determinar,
     • utilizar O,1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otro material por cada mL de líquido de extracción

2. Se describen tres pruebas

   • Prueba de Difusión en Agar
     • reparación de Muestra
       • Usar extractos preparados según se indica o usar porciones de las muestras de prueba que tengan superficies planas con un área de no menos de 100 mm2
     • Preparación de Control Positivo
       • -Proceder según se indica para la Preparación de Muestra.
     • Preparación de Control Negativo-
       • Proceder según se indica para la Preparación de Muestra
     • Procedimiento
       • 7 mL de suspensión de células, preparar las monocapas en placas de 60 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo y reemplazar con medio de cultivo suplementado con suero que contenga no más de 2% de agar. Colocar las superficies planas de la Preparación de Muestra,
         • Preparación de Control Negativo y Preparación de Control, en contacto con la superficie de agar solidificado. Usar no más de tres muestras por placa preparada.
           • Incubar los cultivos durante no menos de 24 h a 37° ± 1 º, en una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1 % de dióxido
     • Interpretacion de los resultados
       • La reactividad biológica se describe y clasifica en una escala de 0-4. Preparación de Control Negativo es grado O (no reactiva) y la de la Preparación de Control Positivo es al menos grado 3 (moderada).
       • si la respuesta de la Preparación de Muestra no es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
   • Prueba de Contacto Directo
     • Este permite la extracción y el análisis simultáneos de sustancias químicas lixiviables de la muestra en un medio suplementado con suero.
     • no es adecuado para materiales de muy baja o muy alta densidad que puedan causar daños. mecánicos a las células.
     • Preparación de Muestra
       • -Usar porciones de la muestra de prueba que tenga superficies planas con un área de no menos de 100 mm2 •
     • Preparación de Control Positivo y negativo .
       • -Proceder según se indica para la Preparación de Muestra
     • Procedimiento
       • Usando 2 mL de suspensión de células preparada, después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de los cultivos y reemplazarlo con 0,8 mL de medio de cultivo recién preparado.
         • Colocar una única Preparación de Muestra, una Preparación de Control Negativo y una Preparación de Control Positivo en cada uno de los cultivos duplicados. Incubar todos los cultivos durante no menos de 24 horas a 37º ± 1 ºen una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1 % de dióxido de carbono. Observar al microscopio cada cultivo alrededor de cada Preparación de Muestra, Preparación de Control Negativo y Preparación de Control Positivo, usando una tinción adecuada, si se desea.
     • Interpretación de los Resultados
       • -Proceder según se indica para la Interpretación de los Resultados en Prueba de Difusión en Agar. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de
   • Prueba de Elución
     • diseñada para la evaluación de extractos de materiales poliméricos.
     • Preparacion de la muestra
       • Preparar según se indica en la Preparación de Extractos, usando una Inyección de Cloruro de Sodio (0,9%) o un medio de cultivo de células de mamífero sin suero como Disolventes de Extracción.
       • Preparar los extractos calentando la muestra durante 24 horas en una incubadora que contenga 5 ± 1 % de dióxido de carbono. Mantener la temperatura de extracción a 37° ± 1 º, ya que temperaturas superiores pueden desnaturalizar las proteínas séricas.
     • Preparación de Control Positivo y negativo
       • según se indica para la Preparación de Muestra.
     • Procedimineto
       • Usando 2 mL de suspensión de células, preparar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo y reemplazarlo con extractos de la Preparación de Muestra, Preparación de Control Negativo o Preparación de Control Positivo. El extracto con Inyección de Cloruro de Sodio se diluye con el medio de cultivo de células suplementado con suero y se analiza por duplicado a una concentración del extracto del 25%. Incubar todos los cultivos durante 48 horas a 37° ± 1 º, preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1 % de dióxido de carbono. Observar al microscopio cada cultivo a las 48 horas, usando una tinción adecuada, si se desea.
     • Interpretacion de los resultados
       • si la respuesta de la Preparación de Muestra no es mayor que grado 2 (levemente reactiva).
       • Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma. Para realizar evaluaciones de la respuesta a la dosis, repetir el procedimiento, usando diluciones cuantitativas del extracto de la muestra.
   • Factores que pueden afectar la aptitud de la muestra para un uso específico son: la composición polimérica, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el medio de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorción, la adsorción y la permeabilidad de los conservantes, y las condiciones de almacenamiento. L

3. Decisión de que tipo de prueba o el número de pruebas a realizar para la evaluación de la posible respuesta biológica de una muestra o extracto específicos

   • depende del material, el producto final y el uso previsto.