Flashcards
Proteinexpression (Praktikum)
Flashcards do conjunto (39)
- 1Was ist ein Plasmid?autonom replizierender ringförmiger Doppel-DNA-Strang in Prokaryoten, 1-1000 kbp groß
- 2Wie ist ein Plasmid aufgebaut?1. origin of replication (ori), Replikationsursprung
2. Selektierbarer marker (z.B. AB-Resistenz)
3. Polylinker/ Multiple cloning site (Schnittstellen für Restriktionsenzyme)
(Bei Vektoren entfernt: Transfergene (tra), bilden Sexpilus aus, und Mobilisierungsgene (mob), führen zu Einzelstrangbruch) - 3Wie wachsen Bakterien?
- 4Wie funktioniert das ampR-Gen?Es produziert beta-Lactamase, welche AB wie Amp/Penicillin/... hydrolysiert
- 5Was hat die Länge des Primers mit der Temperatur vom Primer Annealing zu tun?Die Temperatur beim Primer Annealing ist die Schmelztemperatur. Je länger ein Primer, desto höher die Schmelztemperatur.
- 6Nenne einen exprimierenden E. coli Stamm und seine Eigenschaften.BL 21 (DE3), hat einen T7-Promotor und eine T7-Polymerase (zusammen: starke Expression!), DE3 steht für das Einsetzen dieser T7-Kasette, keine Proteasen
- 7Nenne einen klonierenden E. coli-Stamm und seine EigenschaftenXL1 blue (kompetente Zellen) haben freigelegte Klonierungsmaschinerie, am besten auch aktiviert
- 8Wie berechnet man die Schmelztemperatur eines Primers?Hängt ab von Länge und GC-Gehalt (GC hat mehr H-Brücken und ist deswegen stabiler), meist 18-30 Nukleotide. Ausrechenbar mit Formel (z.B. Wallace-Regel)
- 91. sticky ends 2. blunt ends1. versetzter Schnitt (leichter ligierbar)
2. gerader Schnitt - 10Wie läuft ein Western Blot ab?1. Auftrennung des Proteingemsiches im SDS-Gel
2. Übertragung auf Nitrocellulose-Membran
3. Blotten: Proteine werden hinzugegeben
4. Blockieren der freien Valenzen mit Magermilchpulver
5. Inkubation mit AK, weisen HIS-Tag nach
6. Inkubation mit zweitem AK, weist ersten AK nach und trägt z.B. Meerettich-Peroxidase
7. Nachweis: POD oxidiert Luminol, Zwischenprodukt regiert mit Peroxiden zu Licht/ Fluoreszenz - 11Welche Rolle spielt Mercaptoethanol in der SDS-PAGE?reduziert Disulfidbrücken
- 12Nach was können Proteine aufgetrennt werden?Ladung, Affinität, Größe (auch globulär/ fibrillin), Löslichkeit, Adsorption
- 13Wie läuft die PCR ab?1. Hybridisierung, 95 °C, 45 sek
2. Primer Annealing, 52 °C, 30 sek
3. Elongation, 72 °C, 2 min - 14Wie läuft eine klonierung ab?1. Ligation
2. Transformation in klonierende Vektoren
3. Mini-DNA-Präparation
4. Kontroll-Restriktionsverdau - 15Ist der Reinigungspuffer reduzierend oder oxidierend?Reduzierend, da im Cytosol ein reduzierendes Milieu herrscht.
- 16Aus was besteht Puffer A?KCl, Wasser, Salze (Niedrigsalze, puffern), dTT als Reduktionsmittel, spezielle Komponenten für das Eluat
- 17Was sind Voraussetzungen für ein Restriktionsenzym?Optimale Temperatur, nicht denaturiert, muss spezifische Stellen erkennen
- 18Wie sieht das lac-Operon aus?
- 19Was ist IPTG?Ein künstlicher Induktor, der dieselbe Wirkung wie Lactose auf das Lac-Operon hat.
- 20Welche Mutationen gibt es?Deletion, Insertion, ...
Rastermutation, Punktmutation, ...
STILLE MUTATION! - 21Wie unterscheiden sich gram+ von gram- Bakterien?Im Zellwandaufbau, gram+-Bakterien haben eine diche Mureinschicht, gram--Bakterien das Periplasma ohne Lipoteichonsäuren
- 22Wie kann die Proteinkonzentration bestimmt werden?OD-Messung (auch indirekt), direkt: wegen Tryptophan (280 nm) und wegen der Peptidbindung (unter 230 nm)
- 23Welche Membranen gibt es beim Western Blot, was sind ihre wichtigsten Eigenschaften?1. Nitrocellulose (einfach)
2. PVDF (stabil, aber stark hydrophob, muss deswegen in Methanol aktiviert werden) - 24Wie groß ist der Vektor p28?5369 bp
- 25Was ist der Unterschied zwischen Lumineszenz und Fluoreszenz?(Bio-)Lumineszenz ist das Leuchten nach einer chemischen Reaktion. Fluoreszenz ist die Emission von Licht (Abstrahlung nach Absorption).
- 26Weshalb ist es besser, beim Western Blot zwei Antikörper zu verwenden?Billiger! Ein AK alleine müsste doppelt spezifisch sein (zu dem Protein UND dem Enzym) und ist damit teurer. Zudem kann es zu einer Signalverstärkung kommen, wenn an den ersten AK mehrere zweite AK binden.
- 27Welche Enzyme können sich auf dem Sekundär-AK befinden?Alkalische Phosphatase, Meerettich-Peroxidase
- 28Wie kann Lumineszenz leicht nachgewiesen werden?Röntgenfilm, Fotopapier, ...
- 29Bei welchem Makromolekül wird welches Gel verwendet?Proteine (klein): Polyacrylamid
DNA (groß): Agarose (weitmaschig) - 30Was ist eine diskontinuierliche SDS-PAGE?Im Sammelgel herrscht ein pH von 6,8, sodass Glycin als Zwitterion vorliegt, Chlorid jedoch negativ -> elektrisches Feld -> scharfe Bandenbildung. Im Trenngel ist der pH 8,8, sodass alle Ionen negativ geladen sind -> gleichmäßige Wanderung.
- 31Wie lange braucht die Polymerase für 500 bp?30 sek
- 32wie wird die Proofreading Funktion auch noch bezeichnet?3'-> 5' Exonuklease Aktivität
- 33Wieso wird (v.a. bei der Ligation) vorher trocken zentrifugiert?In der Säule befand sich vorher Ethanol (z.B. in der Wash Solution), welcher die Ligase denaturieren würde. Dieser muss entfernt werden.
- 34Was ist ein Nanodrop?Ersatz für den Restriktionsverdau. Nur wenige μl werden auf ihre OD untersucht.
- 35Wieso werden zwei verschiedene Restriktionsenzyme verwendet?1. Keine Bindung mit sich selber
2. Gen wird richtig herum eingebaut - 36Was bewirkt eine Dephosphorylierung? Was ist der Nachteil?DNA-Enden passen "perfekt zusammen", durch eine Dephosphorylierung nicht mehr (Bindungen werden verhindert). Es kann jedoch zu nicks kommen!
- 37Was ist und macht DTT?DTT (Dithiothreitol) reduziert Sulfidbrücken.
- 38Was ist ein nick?Einzelstrangbruch
- 39Zu was wird Puffer A genutzt?Puffer A wird zum Waschen der Säule genutzt und enthält wenig Imidazol (und NaCl und NaH2PO4). Theoretisch auch keine Protease, kann hier aber vernachlässigt werden da mCherry sehr stabil ist.
Informações
- Descrição
- Biochemie FlashCards sobre Proteinexpression (Praktikum), criado por Svenja em 25-11-2013.
- Criado por
- Svenja
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