Flashcards
molekularbio 4
Cards in this deck (10)
- 1def.: Klonierung VerfahrenKlonierung: Herstellung identischer Kopien
Vorgang
1. Restriktionsenzym(endonuklease) -> zu klonierende DNA u. Vektor zerschneiden
2. kovalente Verknüpfung der DNA-Fragmente => rekombinierte DNA
3. Transformation der rekombinierten DNA in Wirtszelle zur Replikation
4. Identifizierung u. Abtrennung der Wirtszellen mit rekombinierter DNA - 2Enzyme für DNA-Klonierung1) Restriktionsendonuklease Typ II:
- DNA-Spaltung an palindromischen spezifischen BAsensequenzen
2) Ligasen : kovalente Verknüpfung zweier DNA-Fragmente (ATP-verbrauch)
3) DNA-Polymerase I : Auffüllen von Lücken in Duplexen - 3DNA-Klonierungen- warum kommen sie im duett mit methylasen vorMethylierte DNA des Bakteriums wird durch Restriktutionsendonuclease nicht abgebaut (da an erkennungssequenz methyliert)
- 4Aus welchem Organismus stammen Restriktionsendonukleasen u. was ist ihre natürliche Funktion?Aus Bakterien (Bsp. E. coli)
-> Schutz vor Viren u Phagen - 5beschreibe die Gelelektrophorese- Auftrennung der DNA-Fragmente
-------> kleine Moleküle wandern schneller/weiter
- Fragmente in Agarose- o. Polyacrylamidgeltaschen
-elektr. Spannung anlegen
- DNA-Fragmente bekannter Länge zum Vergleich mitlaufen lassen - 6Bsp. für Vektoren in der DNA-klonierung- Plasmidvektoren (E. coli), Lambda-Phagen- Vektor aus , YAC (Hefe)
-> können untersch. große DNA-Fragmente aufnehmen
-Plasmid: extrachromosomales, selbstreplizierendes (wenn ori) DNA-Molekül - 7Was ist MCS?MCS: multi clonig site: DNA-Stück, in dem Erkennungssequenzen für viele Restriktionsenzyme sind
- 8Bsp. zu Klonierung über selektion1. Antibiotika: Vektore enthält Antibiotikaresistenz; Zellen, die Vektore aufgenommen haben, wachsen auf PLatte mit Antibiotikum
2. Blau-weiß-selektion: PLatte mit X-Gal ---ß-galactosidase--> Indigofarbstoff
Zellen aus blauer Kolonie haben intaktes Gen für ß-Gal. -> haben Vektor nicht aufgenommen - 9*def DNA sequenzierung *Methode nach SAnger - Enzyme -Nukleotide*def DNA sequenzierung
=Bestimmung der Abfolge von nukleotiden
*Methode nach SAnger
-Enzyme: Taq-Polymerase hitzebeständig; früher Klenow-Fragment -> keine 5' -> 3' Exonukleaseaktivität
-Mukleotide: dATP,dCTP,....,
ddATP,ddCTP,...... (OH am C2' und C3' fehlt)
wird ddNTP eingebaut, bricht sequenz ab - 10PCR; Wozu? Vorgang?- Zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten
-
1.) Hitze: Denaturierung des DNA-Doppelstrangs
2.) Primer bindet
3.) Taq-Polymerase polymerisiert die Einzelstränge durch dNTPs
4.) Zyklus mehrmals wiederholen
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- hoch molekularbio Flashcards on molekularbio 4, created by Sofia Go on 04/09/2015.
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- Sofia Go
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