PROCESO DE REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO POR MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.

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• REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU RECONOCIMIENTO POR MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.

• Preparar un tubo problema y un tubo testigo.

• Añadir 1.0 mL de Preparación cruda de Transaminasa

• Agregar 0.5 mL de Alanina 100 μmoles/ml.

• Preincubar los tubos a 37° C durante 5 minutos.

• Añadir 0.5 mL de agua destilada únicamente al tubo testigo.

• Agregar 0.5 mL de ácido alfa-cetoglutárico 100 μmoles/mL al tubo problema.

• Incubar los tubos  a 37° C durante 1 hora con agitación ocasional.

• Adicionar 4.0 mL de alcohol 96°.

• Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm.

• Pasar el sobrenadante a un vaso de precipitados y evaporar casi a sequedad en una placa de calentamiento.

• Disolver los residuos con 1 mL de agua destilada.

• REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN

• PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA.

• Cortar una tira de papel Whatman No. 1 de 23 x 57 cm

• Trazar con lápiz, a lo ancho del papel, tres líneas paralelas a 2.5, 6.0 y 8.0 cm en total a partir de uno de los extremos.

• Doblar sobre la primera línea hacia el frente y sobre la segunda hacia atrás.

• Marcar con lápiz en la última línea (8.0 cm) nueve puntos equidistantes.

• En los primeros cinco puntos colocar 5, 10, 15, 20 y 25 PL respectivamente, de una solución de ácido glutámico de 20 Pmoles/mL.

• Usando un secador de aire caliente después de cada aplicación.

• Colocar respectivamente, en los cuatro puntos restantes, 60 PL de los tubos P y T de la reacción de transaminación, 20 PL de agua (testigo para ajustar el espectrofotómetro), y 5 PL de la solución tipo de alanina.

• Secando con un secador de aire caliente después de cada aplicación.

• Saturar el cromatograma durante dos horas en una cámara de cromatografía previamente saturada con el disolvente etanol:metanol:agua-urea (45:45:10:0.5 v/v/v/p)

• Desarrollar el cromatograma durante 18 horas aproximadamente con el disolvente utilizado, hasta que éste haya recorrido tres cuartas partes del cromatograma.

• Sacar el cromatograma de la cámara, marcar el frente de corrimiento y dejarlo secar en la estufa para cromatografía a 70° C hasta evaporar el disolvente.

• REVELADO Y ELUCIÓN DE LAS MUESTRAS

• Revelar el cromatograma por aspersión con una solución de ninhidrina al 0.05% en etanol.

• Colocar el cromatograma en la estufa para cromatografía a 80° C hasta que aparezcan ligeramente las manchas.

• Recortar las manchas correspondientes a la curva tipo de ácido glutámico y también las manchas correspondientes al ácido glutámico formado en los tubos P y T de la reacción de transaminación.

• Recortar una porción de papel a la misma distancia recorrida por el ácido glutámico en el carril donde se aplicó el agua (testigo para ajustar el espectrofotómetro).

• Fragmentar cada una de las porciones de papel y colocarlas en tubos de ensayo, añadir 1 ml de solución de ninhidrina al 1% en butanol para eluir las muestras.

• Colocar los tubos de ensayo en baño maría a 80oC durante 2 minutos. Enfriar en baño con hielo y agregar a cada tubo 5 mL de acetona al 75%.

• Leer en el espectrofotómetro a 540 nm. Ajustar con el testigo correspondiente.

• Calcular la concentración de ácido glutámico obtenido por acción de la transaminasa.