TÉCNICA WESTERN BLOT

Western Blot

Procedimiento

Es una técnica analítica usada para detectar una proteína especifica en un extracto crudo, mediante el uso de anticuerpos

La técnica usa tres pasos para llevarla a cabo

1) La separación de proteínas por peso molecular en geles de poliacrilamida

2) La transferencia a una membrana o soporte sólido, que permite su manipulación

3) El marcaje de la proteína blanco utilizando un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario acoplado a una molécula que permite su visualización.

Materiales

1. Gel con proteínas cargadas y separadas previamente

2. Cámara de transferencia semiseca para Western blot

3. Papeles whatman No1 o 2 del tamaño del gel

4. Recipientes del tamaño del gel

5. Membrana de PVDF o nitrocelulosa

6. Bisturí o tijera

7. Fuente de poder

CARGA Y CORRIDA DEL GEL

En el primer carril cargue el marcador de peso molecular. NOTA: se usan preferentemente marcadores preteñidos

Cargue concentraciones entre 20-30 μg de proteína total o de 10-100 ng de proteína purificada y llévelos a volúmenes iguales y colóquelos en los pozos del gel SDS-PAGE

Corra el gel durante 40 min – 1 hora a 150 V o 35mA. NOTA: El tiempo y corriente eléctrica pueden requerir optimización

Transferencia semi-seca de las proteínas del gel a la membrana

Después de correr el gel de poliacrilamida se deja el gel en buffer WBTB 1X

Se equilibran las membranas de PVDF colocándolas en metanol durante 1 minuto y posteriormente se lavan con buffer WBTB 1X; si es de nitrocelulosa se coloca en el buffer WBTB 1X

Se colocan 3 papeles whatman del tamaño de la membrana empapados de buffer WBTB 1X

Posteriormente se coloca la membrana previamente equilibrada y lavada

Y enseguida se coloca el gel sobre la membrana y 3 papeles whatman encima del gel.

Se cierra cuidadosamente la cámara y se conecta a la fuente de poder.

La transferencia de proteínas de la membrana se puede verificar usando la tinción con Rojo Ponceau S antes del paso de bloqueo o marcadores preteñidos.

Terminando la transferencia se bloquea con Albumina bovina sérica (BSA) al 5% o con leche descremada al 5% en TBST 1X por 10min en agitación

Se hacen 3 lavados con TBST 1X y se preparan los anticuerpos según las recomendaciones del fabricante en TBST (1:10,000, 1:5000, etc.)

Se puede dejar toda la noche en agitación a 4°C o a temperatura ambiente 2 horas

Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min

Se prepara y coloca el anticuerpo secundario con las características del fabricante y se deja en agitación a temperatura ambiente 2 horas

Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min

Dependiendo de la molécula con la que este acoplado el anticuerpo secundario será el procedimiento a seguir

Si los anticuerpos están acoplados a HRP se pueden realizar una reacción colorimétrica con Carbazol

Agregue en un tubo de 15mL, 2.25 mL de la disolución Stock de Carbazol, y posteriormente agregue 6 mL de buffer de Acetatos y 15 µL de H2O2

Coloque la membrana en un recipiente y posteriormente la mezcla de Carbazol y espere a que las bandas se tiñan de un color Rojo carmesí