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1. PARTE I. Coloración Simple Preparación del frotis. • Colocar una gota de agua destilada estéril, en el centro de una lámina limpia, desgrasada y debidamente identificada. • Remover el tapón del tubo de cultivo conservándolo en el dedo meñique. Flamear la boca del tubo. • Introducir el asa estéril (flameada y fría). En el tubo con cultivo y rozarla suavemente el área con crecimiento bacteriano. • Flamear la boca del tubo y taparlo de nuevo. • Colocar el tubo en la gradilla. • Con el asa cargada, realice un pequeño círculo dentro de la gota de agua. Dejar secar al ambiente. • Flamear el asa. • Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. • Fijar la muestra pasando el frotis varias veces por la llama del mechero.

   • PARTE II. Tinción de Gram. Cajas con: S. aureus y E. coli Trabaje todo el procedimiento frente a la llama del Mechero Bunsen. • Trabaje con sus cajas de Petri que contiene las cepas antes indicadas. • Destape con cuidado una a una las cajas de Petri. • Prepare con mucha precaución tres frotis con diferente tipo de colonia (según metodología establecida con anterioridad) • Cubra los frotis con solución cristal violeta y déjelo por un minuto. • Lave con agua de chorro y escurra. • Cúbrala con solución de Lugol durante un minuto
     • • Lávela con agua de chorro, escurra. • Gotee alcohol acetona sobre preparación, hasta que este deje de soltar color violeta. (unas 4 a 6 gotas) LAVE INMEDIATAMENTE. • Cubra la lámina con Solución de Safranina, durante un minuto. • Escurra el colorante y lave la lámina con agua de chorro, escurra y deje secar a temperatura ambiente
       • PARTE III. Tinción de Ziehl Neelsen. • Con las láminas ya preparadas, realice la coloración para BAAR (bacilos alcohol acido resistente). • Cubra el frotis con Fascina Fenicada y caliente suavemente por debajo de la lámina, con la llama de un mechero (de alcohol) hasta que se produzca emisión de vapores blanquecinos visibles. • Espere 5 minutos y luego llave con agua de chorro, para eliminar el exceso de colorante. • Cubra el extendido con Alcohol Acido al 3 %, esperar 30 segundos o hasta que la coloración del extendido alcance un rosado pálido. • Cubra el extendido con el colorante Azul de metileno y espere 30 segundos. • Lave con agua corriente, escurra y deje secar el extendido al aire, NO frotar.
         • PARTE IV Tinción para Cápsula. Trabaje todo el procedimiento frente a la llama del Mechero Bunsen • Trabaje con la caja de Petri, que contiene las cepas de Klebsiella sp. • Coloque una gota de agua destilada estéril, en el extremo de una lámina. • Destape con cuidado la caja de Petri, escogiendo únicamente una de las colonias presentes, tómela con el asa debidamente flameada y fría y extienda la pequeña cantidad del cultivo sobre la gota de agua. • Usando el asa, extienda la suspensión en un tercio de la lámina y deje secar al aire. • Fije la preparación pasando la lámina dos o tres veces por la llama de un mechero (dejando el lado donde se hizo el frotis por arriba.). • Cubra la preparación con Azul de Metileno, deje 5 minutos, lave con agua de choro y escurra. • Deje secar al aire. • Agregue una gota de tinta china Parker, y con el extremo de otra lámina porta objetos realice un frotis sobre la preparación, en un ángulo de 45°.
           • Parte V. Tinción de esporas. Preparar un frotis de B. cereus y fijarlo a la llama • Cubrir toda la lámina con verde de malaquita y calentar hasta que haya emisión de vapores, manteniéndola así durante 5-10 minutos. Evitar la ebullición y agregar colorante si se deshidrata la lámina. • Lavar la lámina con agua del chorro durante medio minuto y luego cubrirla con safranina por 30 segundos. • Lavar la lámina con agua de chorro, escurrirla, dejarla secar y observar con objetivo de inmersión. • Resultado: Positivo: esporas de color verde y bacilos de color rojo.
             • PARTE VI. Observación al Microscopio. • Agregue una gota de aceite de inmersión, a cada uno de los frotis o extendidos. • Utilice el objetivo de inmersión. • Anote a continuación los resultados obtenidos, acompañado de ilustraciones esquemáticas.