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Inmunoensayos

Misael Sanchez English

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Inmunoensayos

Enzimo-inmunoensayos
- ELISA
  - Tecnica más utilizada para cuantificar proteínas solubles
    - En
      - Fluidos Corporales
      - Medios de Cultivo de Laboratorio
  - Tipo Sandwich
    - Se sensibiliza a los posillos con un anticuerpo especifico para un antigeno
      - Se realiza el mismo procedimiento
    - Se añade suero
      - Se realiza el mismo procedimiento
    - Se añade Anticuerpo anti-proteína serica marcada
      - Formando inmunocomplejo IgG-proteína serica-IgG
      - Se realiza el mismo procedimiento
  - Indirecto
    - Procedimiento
      - Se sensibiliza a los posillos sensible a protepinas con el antigeno
        Se realizan 3 lavados
        Se bloquea con BSA para evitar uniones inespecificas
      - Se añade suero del paciente
        Provocando reaccion Ag-Ab
        Se lavan nuevamente los posillos
      - Se añade anticuerpo anti-IgG humana con una enzima conjugada
        Se realizan 3 lavados
        Se añade sustrato (cromogeno)
        Si hubo reaccion generara una sustancia coloreada
        Si no huno reaccion no habra viraje en el color
        Peroxidasa
- Inmunohistoquímica
  - Se utiliza sobre tejidos
  - Aplicación directa de anticuerpo monoclonales o policlonales marcados enzimaticamente
    - Permite
      - Localizacion microanatomica de subestructuras
      - Caracterización morfologica
- Western-Blot
  - Inmuno-Blot
    - Se adhiere antigeno
      - Tira de Nylon
      - Tira Nitrocelulosa
    - Luego se añade suero pacientes
      - Se añade Anticuerpo conjugado (anti-Ig) marcado con enzima
        Se añade sustrato
  - Se realiza en soportes solidos
  - Sobre los soportes se inmovilizaron antigenos
    - Separados por Electroforesis
    - Identificación
      - Incubación del soporte con anticuerpos marcados con enzimas
      - Se agrega el sustrato
        Provocando el viraje del color
Precipitación/Aglutinación
- Aglutinación
  - Antigeno forma parte de un elemento
    - Bacterias
    - Hematies
    - Parasitos
  - Algunas tecnicas
    - Determiancion grupo sanguineo
    - Aglutinación Bacteriana
- Identificacion de Proteinas Solubles (Aglutinación)
  - Inmunoelectroforesis
    - Antigenenos se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
    - Lateralmente a la electroforesis se depositan anticuerpos en una ranura
      - Formando así lineas de precipitacion
        Que podran compararse con un estandar
  - Nefelometría
    - Permite detectar precencia de inmunocomplejos
      - Por la dispercion de rayos de luz que estos producen
    - Se hacen pasar rayos de luz por
      - Recipientes que contienen
        Antigeno
        Anticuerpo
  - Inmunodifución Doble
    - No contiene anticuerpos en el gel de Agarosa
      - Anticuerpo y antigeno son depositados en dos posillos
      - Ambos difunden por el gel
      - Hasta formar una linea d eprecipitación
        Segun la posicion de la linea se puede estimar la concentración
  - Inmunodifusion Radial
    - Identifica/ Cuantifica
      - Proteínas de Suero
      - Otros fluidos corporales
    - Antigenos
      - Difunden desde un pocillo central
      - Atraviesan un gel de agarosa con anticuerpos policlonales
      - Complejos Ab-Ag precipitan en forma de anillo
        Se miden los diametros y se compara con un estandar
        Estandar a Concentracion conocida permite realizar un patrón
Radioinmunoensayos
- Inmunoprecipitación
  - Fundamento
    - Se precipita proteína de interes de un extracto célular
    - Proteína es separa por electroforesis
    - Finalmente revelada con aticuerpo radioactivo
- RIA
  - Fundamento
    - Antigeno compite con cantides de ese mismo antigeno marcado radioactivamente
      - Para unirse a un anticuerpo para ese antigeno
    - Niveles detectados de raduioactividad despues del la reacción Ag-Ab
      - Comparados con curva estandar Radioactivad vs [Ag]
- Autor: Misael Sánchez Morales. Bibliografía: Regueiro González JR, López Larrea C, Rodríguez González S, Martínez Naves E (2008) Inmunología. Biología y Patología del sistema inmune. 3° Edición. Editorial Médica Panamericana.ISBN 847903707.
Inmunofluorescencia
- Inmunofluorescencia directa
  - Antigeno/Anticuerpo inmuno marcado
    - Relacionados directamente
- Inmunofluorescencia indirecta
  - Detecta
    - Autoanticuerpos
    - Contra un determina tejido
  - Procedimiento
    - Celulas de tejidos fijadas en un portaobjetos
    - Se añade suero del paciente
    - Se añade anti-IgG humana conjugada con un fluorocromo
    - Se observa en un microscopio
  - Mas sensible que la directa
    - Varios anti IgG pueden reconocer un solo anticuerpo
      - Haciendo que la señalizacion sea más intensa
- Citofluorometria de flujo
  - Bases
    - Suspensión celular fluye por una camara vibratoria
    - Celulas pasan de una en una a traves de una luz laser a 488n nm
    - Permitiendo obtener información sobre forma o complejidad celular
  - Fundamento
    - Penumbra producida por la celula al pasar por el laser
      - Otorgando informació acerca de su forma
        Detectada mediante el detector frontal
    - Luz que entra por el citoplasma
      - Refractada por superficie celular
        Deteccion mediante detector lateral 90°C
        Otorgando informacion sobre tamaño y granularidad
    - Si se consigue
      - Fluorescencia sobre la célula
        Laser excitara fluorocromos
        Obteniendo información acerca de estructuras teñidas
        ADN, lipidos de membrana, iones citoplasmaticos, proteínas membranales o intracelulares