TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

1. Conjunto de métodos empleados para localizar, aislar, alterar, estudiar y recombinar secuencias de ADN

2. Aplicaciones

   • Investigación a nivel molecular
   • Biotecnología
   • Enfermedades

3. TÉNICAS

   • Digestión del ADN con enzimas
     • Enzimas de restricción
       • Nucleasas que reconocen y cortan secuencias específicas de nucleótidos
       • Reconocen secuencias palindrómicas
       • Tipo de corte
         • Extremos cohesivos
           • Cortar el ADN donante y vector con la misma enzima
           • Formación de puentes de H con la secuencia complementaria
         • Extremos romos
           • Donante y vector no tienen por qué contener el sitio de restricción
     • Mapas de restricción
       • Digestión del ADN lineal con enzimas HindIII y SalI
       • Los fragmentos de restricción migran en un gel de agarosa
     • Construir moléculas recombinantes
     • Buscar fragmentos en mezclas complejas
   • Construcción ADN recombinante
     • 1. Extracción del ADN
       • Donante
         • Digestión de células
         • Precipitación con alcoholes
       • Vector
         • ADN plasmídico
         • Fago I
     • 2. Corte en extremos
     • 3. Ligación ADN
       • Donante y vector se mezclan
       • Formación de muchas moléculas de ADN recombinantes distintas
       • Sellamiento de extremos con la ADN ligasa
     • 4.Transformación
       • Vectores de clonación
         • Tipos
           • Plásmidos
             • pBR322
             • pUC18
           • Fago landa
           • Cósmidos
             • Vectores híbridos (fago landa + plásmido)
             • Sitios Cos (señales de empaquetamiento)
           • Otros
             • BACs
             • YACs
             • Para células eucariotas
               • Vectores no víricos
                 • Liposomas
                   • El transgen se introduce en vesículas de lípidos
                   • Proceso de baja eficiencia y selectividad
                 • ADN "desnudo"
               • Vectores víricos
                 • Retrovirus
                   • Integran pequeños segmentos de ADN
                   • Integración permanente del transgen
                 • Adenovirus
                   • Integran ADN de gran tamaño
                   • La expresión del transgen desaparece con el tiempo
                 • Lentivirus
               • Plásmido Ti en plantas
             • Vectores de expresión
         • Replicación autónoma
         • Mapa de restricción conocido
         • Marcadores específicos
         • Recuperación sencilla
     • 5. Amplificación y selección
   • Genotecas de ADN
     • Número de clones depende de
       • Tamaño genoma
       • Tamaño inserto
     • Tipos
       • cDNA (ADN complementario)
       • Genómicas
       • Cromosómicas
   • Hibridación ácidos nucleicos
     • Southern Blotting
       • ADN digerido con una enzima de restricción
       • Fragmentos parcialmente hidrolizados
       • Marcaje de sondas
     • Nothern Blotting
       • Transferir fragmentos de ARN desnaturalizado de un gel a un medio sólido
       • Sonda
     • FISH
     • Colonias bacterianas
   • Análisis de ADN clonado
     • PCR
     • Secuenciación método de Sanger