Determinación del contenido de proteína en hojas

Determinación del contenido de proteína

Material biológico:

1)Tejido del material vegetal a analizar

Reactivos:

1)Nitrógeno líquido,

2)Acetona,

3)Agua destilada,

4)Fosfato dibásico de potasio trihidratado,

5)Fosfato monobásico de potasio,

6)Fosfato monobásico de sodio trihidratado,

7)Fosfato dibásico de sodio anhidro,

7)EDTA disódico,

8)Soluciones de HCl y NaOH para ajustar pH,

9)Etanol 98 %, ácido o-fosfórico 85%,

10)Coomassie Brilliant Blue G-250,

11)Albúmina sérica bovina (Bio-Rad, protein assay standard II),

12)HCl 37 %.

Material analítico:

1)Tubos de reacción tipo falcon de 15 mL

2)Tubos de reacción tipo eppendorf de 1,5 mL

3)Juego de micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL)

4)Puntas para micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL)

5)Vasos de precipitados

6)Celda de cuarzo de 1 cm de paso óptico para espectrofotómetro

7)Gradilla para tubos de 15 mL y de 2,0 mL

8)Espátula

9)Equipo personal de seguridad (guantes, gafas, bata de laboratorio)

10)Toallas de papel absorbente

11)balón aforado de 1,0 L

12)Agitador magnético

13)Papel aluminio.

Equipos:

1)Agitador horizontal,

2)Centrífuga refrigerada,

3)Espectrofotómetro,

4)Balanza analítica o semianalítica,

5)Tanque para transporte de nitrógeno líquido,

6)Potenciómetro,

7)Plancha de agitación magnética,

8)Cabina de extracción,

9)Vórtex

Buffer de extracción de proteínas- Fosfato de potasio 100 mM pH 7,5, EDTA-Na2 1 mM:

Buffer de fosfato de sodio 100 mM pH 6,80, para curva de calibración:

Agregar 100 mL de ácido fosfórico 85%

Colorante Bradford:

Aproximadamente 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250

Disolver en 50 mL de etanol 95%

Agitar fuertemente y en oscuridad

Aforar a 1,0 L con agua destilada fría

Agitar por una hora

Filtrar dos veces

El conjunto de reactivos se deposita en un vaso de precipitados

2,3135 g KH2PO4 (PM 136,09 g/mol),

7,5316 g K2HPO4.3H2O (PM 228,23 g/mol),

0,1861g EDTA-Na2 (PM 372,23 g/mol)

Conservar en un frasco debidamente rotulado a 4 ºC.

Aforar a 100 mL con agua destilada fría

Ajustar a pH 6,8

Agitar hasta disolución completa

Disolver en 80 mL de agua destilada fría

El conjunto de reactivos depositarlo en un vaso de precipitados

1,2444g de NaH2PO4.3H2O (PM 173,98 g/mol),

0,4042 g de Na2HPO4 (PM 141,96 g/mol)

Disolver en 350 mL de agua destilada fría

Agitar hasta disolución completa

Ajustar pH a 7,5

Afora a 500 mL con agua destilada fría

Pesar en la balanza analítica

Pesar en la balanza analítica

Conservar en un frasco debidamente rotulado a 4 ºC.

Pesar en la balanza analítica

Agitar fuertemente y en oscuridad

Conservar en un frasco ambar debidamente rotulado a 4 ºC.

Curva de calibración:

Agregar 800 µL de reactivo de Bradford, tapar el tubo e invertir suavemente cinco veces para evitar la formación de espuma

Construir la gráfica: µg/µL proteína (X) Vs. A 590nm /A 450nm (Y)

Preparación de las muestras

Dejar en reposo por 15 minutos y determinar la absorbancia a 590 nm y 450nm (Usando como blanco el buffer)

Macerar hojas frescas sin nervaduras con N2 líquido hasta obtener un polvo fino y conservar a -80ºC hasta su tratamiento final.

Homogenizar con vórtex por 10 segundos

Colocar en un tubo de reacción de 2 mL la cantidad (según la tabla) de buffer fosfato de sodio 100 mM pH 6,8

Preparar las siguientes mezclas de reacción para la curva de calibración:

Posteriormente la cantidad (según la tabla) de patrón de BSA

Se realiza para cada nivel de concentración por triplicado con un patrón de BSA 1,45 mg/mL

Centrifugar 30 minutos a 6000 rpm y 4ºC

Separar el sobrenadante (extracto proteico), para la determinación inmediata del contenido de proteína

Incubar durante 1 hora sobre cama de hielo en agitador horizontal

Homogenizar por dos minutos en vórtex sobre cama de hielo

Adicionar sobre el macerado 5 mL de buffer fosfato de potasio 100 mM pH 7,5

Pesar aproximadamente 0,50 g de macerado en un tubo de reacción de 15 mL tipo falcon de fondo cónico previamente rotulado.

Realizar el procedimiento por triplicado

Procesamiento de muestras

En caso que se presenten valores por fuera de la curva de calibración se prefiere repetir el procedimiento con menos cantidad de extracto debido a que el proceso de dilución afecta la determinación.

Interpolar en la gráfica: µg/µL proteína (X) Vs. A 590nm /A 450nm (Y)

Determinar la absorbancia a 590nm y 450nm

Dejar en reposo por 15 minutos

Agregar 800 µL de reactivo de Bradford, tapar el tubo e invertir suavemente cinco veces para evitar la formación de espuma

Colocar en un tubo de reacción de 1,5 mL, 200 µL de extracto proteico y realizar determinación por triplicado.