Determinación de Malondialdehido (MDA) en muestra de tejido vegetal

Determinación de Malondialdehido (M.D.A.) en muestra de tejido vegetal

En la prueba de reacción del ácido tiobarbutírico (TBA) para detección de malondialdehido (MDA), una molécula de MDA reaccióna con dos moléculas de TBA, produciendo una sustancia (MDA+((TBA)2)) de pigmentación rosa con una absorbancia máxima a 532-535 nm.

La reacción debe ser llevada a cabo a un pH 2-3, a 90-100 ° por 10-15 min.

Para precipitar las proteínas, usualmente el tejido muestra es mezclado con dos volúmenes de ácido tricloracético frío al 10% (m/v)

Por medio de la centrifugación, el precipitado es transformado en pellets o gránulos

Una alícuota del sobrenadante es tomada y se hace reaccionar con un volumen igual de 0.67% (m/v) TBA en un baño de agua en ebullición por 10 min.

Después de dejar enfriar la muestra, se lee la absorbancia a 532 nm y la concentración de MDA es calculada usando el valor base de 153,000.

El reactivo TBA debería ser preparado como una solución acuosa y requiere calor para disolver el TBA sólido.

Una curva de estandarizacion puede ser preparada usando malonaldehido bisdimethil o bisdiethilacetal como fuente de MDA

Una solución stock es preparada al adicionar 1 mmol de acetal a 100 ml de ácido sulfúrico al 1% (v/v) y dejando la mezcla en un cuarto temperado por 2 hr para lograr la hidrólisis completa.

Para la preparación de la curva de estandarización, el stock de MDA está diluido entre 1- 10/~M y luego reaccióna con el TBA.

Hidroxitolueno butilado (BHT) y EDTA se añaden a la muestra y mezcla de reacción para minimizar la oxidación de lípidos.

La temperatura de reacción de las muestras tiene que ser reducida para minimizar la descomposición de las hidroperoxidasas lipidicas

Reactivos (almacenarlos de 2-8 °C):

2- Ácido thiobarbiturico, en polvo, 5 botellas

Hidroxitolueno butilado en etanol, 2.0 mL vial

1M de ácido fofórico, 5 x botellas de 10 mL

Buffer de fosfato, a de pH 7.0 con EDTA, botella de125 mL

Tetrametoxipropano en un buffer estabilizador a 4,3,2,1 y 0 µM equvalentes de MDA; de 2.5 mL cada uno

Materiales analíticos:

Pipetas ajustables con capacidad de volúmenes de10 y 250 µL

Puntas de pipeta para pipetas de volúmenes de10 y 250 µL

​Barra para agitar, de más o menos 0.3 cm

Tubos de microcentrífuca de polipropileno

Semi-micro cubetas (plásticas, de vidrio o cuarzo)

Agua deionizada

Spectrofotometro

Vortex

Agitador magnético

Bloque de calentamiento en seco o baño maría a 60°C

Microcentrifuga

Preparación del TBA

Añadir 10.5 ml de agua deionizada a un vaso de precipitado con TBA

Introducir en el vaso de precipitados lo imanes del agitador magnético y mezclar en el agitador durante aproximadamente 10 min, hasta disolver todo el TBA.

Almacenar el TBA reconstituido a temperatura ambiente y NO refigreara.

Ácido tiobarbituric (TBA) 99%

Sal de tetrabutilamonio de Malondialdehido (sal de MDA) al 96%

Methanol al 99.8%

Ácido acético glacial al 99%

Agua destilada y desionizada con menos de 5 mΩ

Preparación de solución estandar de TBA a 4.0 mM

Disolver 57.66 mg de TBA en 100ml de ácido acético glacial en un vaso de precipitados

Preparación de la solución madre de MDA y las diluciones de calibración

Disolver 31.35 mg de sal de MDA en 100ml de ácido acético glacial en un vaso de precipitados para formar la solución madre

Preparar cinco diluciones de la solución madre a 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8mM

Con los valores del espectofotómetro, preparar una curva de calibración

Preparación de la muestra

Diluir un gramo de la muestra macerada en 5ml de solvente (ácido acético glacial al 100% o ácido acético glacial al 50% en agua), en un tubo de ensayo de 25ml. Se puede usar BHT al 0.01% para evitar la oxidación temprana del medio.

Agitar por una hora

Filtrar

Centrifugar lo filtrado

Tomar de cada dilución 1ml y mezclar con 1ml de solución estandar de TBA

Calentar las muestras en un baño maría a 95°C por 60 min

Dejar reposar las mezclas hasta que alcancen la temperatura ambiente

Medir la absorbancia de las mezclas y una muestra blaco (de agua o ácido acético) a 532 nm en el espectofotómetro

Mezclar 1 ml de la muestra procesada con 1 ml de solución estandar de TBA

Calentar las muestras en un baño maría a 95°C por 60 min

Dejar reposar las mezclas hasta que alcancen la temperatura ambiente

Medir la absorbancia de las mezclas y una muestra blaco (de agua o ácido acético) a 532 nm en el espectofotómetro

Calcular las sustacias reactivas al ácido tiobarbutirico o TBARS

Ensayo de TBA/TCA para determinación de Malondialdehido (M.D.A.) en muestras de tejido vegetal

Preparación de solución estandar de TBA al 0.5% en TCA al 20%

Diluir 20 g de la TCA en 80 ml de agua destilada y deionizada, en un vaso de precipitados

Añadir 0.5 g de TBA a la mezcla

Poner un plato de vidrio sobre el vaso de precipitados

Calentar el vaso de precipitados a 80 °C y agitar, todo dentro de una campana de extracción. Mantener durantre 30 min o hasta disolver el TBA

Dejar reposar la mezcla hasta que alcancen la temperatura ambiente

Transferir la mezcla a un frasco volumétrico de 100 ml y ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada y deionizada

Preparación de solución estandar de TCA al 0.1%

Diluir 0.1 g de la TCA en 100 ml de agua destilada y deionizada, en un vaso de precipitados

Preparación de la muestra y su réplica

Sacar la muestra del congelador a -80°C e ingresarla en nitrógeno líquido, en un tubo de ensayo

Añadir dos cuencas de carburo de tugsteno e ingresar la muesta en el mixer mill por 3.5 min a 30Hz

Trabajando en hielo, sacar las muestraas y añadir 1ml de TCA al 0.1 %

Mezclar en el vortex hasta homogeneizar

Centrifugar la mezcla durante 10min a 13000rpm, a 4°C para formar un pellet

Pincha un hueco con una aguja de jeringa en la tapa de un tubo ependorf de 2 ml

En el tubo pinchado ingresar 1 ml de solución estandar de TBA al 0.5% en TCA al 20% y añadir 400 ul de muestra procesada (400 ul de solución estandar de TCA al 0.1% para el blanco). Esta es una dilución en 3.5 veces

Cerrar las tapas pinchadas e incubar por 30 min a 80 °C en baño maría o bloque de calentamiento en seco

Al terminar el tiempo de incubación, ingresar los tubos a hielo y esperar 5 min o hasta que tengan una temperatura similar al hielo

Centrifugar la mezcla durante 5 min a 13500rpm, a 4°C para formar un pellet de cualquier TBA precipitado

Transferir 200 ul de sobrenadante a los platos 96 buenos. Recuerda hacer una réplica

Medir la absorbancia a 532 y 600 nm

Calcular el MDA