HEMOCULTIVO - Alberth Ticona Quincho

Clasificacion
1. Segun tipo de paciente
  1. Pediatrico
  2. Adulto
  3. Inmunocompetente
  4. Inmunosuprimido
2. Segun toma de la muestra
  1. Centrales
  2. Perifericos
3. Segun tipo de Microorganismo
  1. Bacterias aerobicas
  2. Bacterias anaerobicas
  3. Bacterias fastidiosas
  4. Micobacterias
  5. Hongos
4. Segun la Metodologia
  1. Manuales
    1. Convencional
      1. Observación macroscópica de los signos de crecimiento de una pareja de frascos con medio de cultivo líquido, en los que se ha inoculado la sangre del paciente.
    2. Bifasico
      1. Compuesto de una fase sólida y otra líquida. Al inclinar el frasco, el medio líquido cubre totalmente el medio sólido, realizando un subcultivo en el mismo cuantas veces se desee, sin necesidad de abrir la botella.
  2. Semi-automatizados
    1. Lisis-Filtracion
      1. Despues de la lisis de las células sanguíneas, se procede a filtrar la sangre para retener las bacterias. El filtro utilizado, o fragmentos del mismo, se siembra en distintos medios de cultivo.
    2. Lisis-Centrifugacion
      1. Tras la inoculación de la sangre, se lisan las células.
      2. Se centrifuga el tubo a 3.000rpm durante 30 minutos.
      3. Después se desecha el sobrenadante y se siembra el sedimento en distintos medios de cultivo.
    3. Manometrico
      1. La producción de gas durante el crecimiento bacteriano provoca un aumento de la presión desplazando el medio de cultivo líquido a través de la aguja introduciéndose en la cámara.
      2. Consta de una botella con caldo de cultivo a la que, se le acopla una pequeña cámara con una aguja que llega hasta el fondo del medio líquido.
  3. Automáticos
    1. Radiométricos
      1. Mide periódicamenrte el nivel de 14CO2 y se expresa como un índice de crecimiento cuando se compara con los niveles de CO2 en frascos de control.
    2. No Radiométricos
      1. Los sistemas Bactec NR-660 y NR-730 detectan el CO2 por espectrometría de infrarrojos.
    3. Monitorizacion Automatica
      1. Bactec-9240
        Los fotosensores miden el nivel de fluorescencia cada 10min, que se corresponde con la cantidad de CO2 producida por el microorganismo.
      2. Sistema Vital (bioMerieux)
        El metabolismo microbiano produce cambios en el pH, en el potencial redox o en el nivel de CO2 que provoca una disminución de la fluorescencia del indicador.
      3. ESP (Difco Laboratories)
        Los frascos se colocan en cajones y los de anaerobios no se agitan. El crecimiento se mide por un método manométrico que detecta el consumo y/o la producción de gas.
      4. BacT/Alert (Organon Teknica)
        Detecta el CO2 producido por el crecimiento microbiano utilizando un sensor colorimétrico interno pegado al fondo de los frascos.
        A medida que cambia el color del sensor, la cantidad de luz reflejada se incrementa y es cuantificada como un aumento del voltaje.
Importancia Clinica
1. Deteccion de:
  1. Bacteriemias
    1. Clasificacion
      1. Transitoria
        Abscesos, Forunculos, Manipulacion dental, Celulitis, Endoscopia GI, Neumonias, Meningitis, Artritis septica
      2. Intermitente
        Abscesos que no drenan (intraabdominales, pelvicos, hepaticos, prostaticos), Infecciones focales que simulan neumonitis u osteomielitis.
      3. Continua
        Endocarditis, tromboflebitis infectadas, aneurismas, brucelosis, fiebre tifoidea.
    2. Agentes etiologicos
      1. Gram positvas
        Staphylococcus aureus
        Estafilococos coagulasa negativa
        Enterococus sp.
        Streptococus pneumoniae
        Streptococcus pyogenes
      2. Gran Negativos
        Escherichia Coli
        Pseudomonas aeruginosa
        Bacteroides fragilis
        Klebsiella pneumoniae
  2. Septicemia
    1. Agentes Etiologicos
      1. Gram positiva
        50% por estafilococos (exotoxinas)
      2. Gram Negativa
        LP endotoxina por enterobacterias o Pseudomonas
      3. Micobacterias (Glucolipidos)
      4. Hongos (mananos)
        Candida albicans
      5. Antigeno (exotoxina)
        Patrones Moleculares Asociados a Patogenos (PAMPS)
        Activa cadena inflamatoria
    2. Se debe tener en cuenta 2 a mas de los siguientes parametros
      1. Fiebre mayor a 38°C o hipotermia (temperatura menor de 36°C).
      2. Taquicardia mayor a 90 pulsaciones por minuto.
      3. Taquipnea mayor a 20 por minuto o pCO2 menor de 32 mm de Hg.
      4. Leucocitosis mayor a 12.000 leucocitos/mm3.
      5. Leucopenia menor a 4.000 leucocitos/mm3 .
  3. Fungemias
    1. Agentes Etiologicos
      1. Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis
        Representan el 95% de candidiasis
      2. Levaduras
        Malassezia globosa
        Infecciones invasoras en enfermos inmunodeprimidos
        trichosporum beigelli
        Piodermitis, Endocarditis, Fungemia
        Rhodoturula
        Fungemia asociada a cateter
        Cryptococcus neoformans
        Levaduras inhaladas, infectan el alveolo
    2. Es más frecuente en pacientes con inmunosupresión o inmunodeficiencia con fuerte agranulocitosis, enfermos de cáncer o en pacientes con catéteres intravenosos.
2. Criterio clinico para solicitar hemocultivo
  1. Pacientes con fiebre ≥ 38ºC o cuya temperatura sea inferior a 36ºC
  2. Pacientes con leucocitosis o leucopenia
  3. Pacientes con trombopenia o alteraciones de la coagulación de causa no filiada
  4. Pacientes con infección focal de etiología no aclarada
  5. Pacientes con deterioro uni o multiorgánico, shock o inestabilidad hemodinámica
  6. Neonatos ante la mínima sospecha de infección
  7. Pacientes con susceptibles a padecer meningitis, osteomielitis, pielonefritis, infeccion intraabdominal, artritis, infecciones graves de piel o tejidos blandos, neumonia, endocarditis, fiebre tifoidea, brucelosis
Cultivo
1. Tipos de Cultivo
  1. Cultivo Aeróbico
    1. El medio de transporte es el Stuart o Amies, que está constituido por agar-agar, un buffer y agua.
      1. Cultivo Aeróbico Superficial
      2. Cultivo Aeróbico Profundo
  2. Cultivo Anaeróbico
    1. El caldo de cultivo para bacterias anaeróbicas es el tioglicolato de sodio que contiene sustancias reductoras del potencial de óxido reducción y está contenido en un tubo o frasco hermético.
2. Frascos de Cultivo
  1. Dos o tres frascos con medio de cultivo (caldo de soya y caseína tsa), teniendo en cuenta lo siguiente:
    1. Para Hemocultivos de rutina
      1. Un frasco para cultivo anaeróbico (frasco tapa amarilla)
      2. Dos frascos para cultivo aerobico (frasco tapa azul)
    2. Para pacientes que estén recibiendo terapia antimicrobiana
      1. Un frasco para cultivo anaeróbico (frasco tapa amarilla)
      2. un frasco para cultivo aeróbico para bacterias y levaduras (frasco tapa azul)
      3. Un frasco con resina para absorber antibióticos (frasco tapa gris).
    3. Para cultivos de hongos
      1. Dos frascos para hongos (frasco tapa verde).
    4. Para cultivos de micobacterias
      1. Dos frascos para micobacterias (frasco tapa blanca).
TIPO DE MICROORGANISMOS
1. GRUPO A
  1. Nunca son contaminantes
2. GRUPO B
  1. Raramente son contaminantes
3. GRUPO C
  1. 50% de las veces son contaminantes
4. GRUPO D
  1. La mayoria de las veces son contaminantes
PROCEDIMIENTO
1. A. PREPARACION DE LA PIEL
  1. 3) Una vez determinado el sitio de punción, desinfectar la piel con solución de iodo-povidona al 10%.
  2. 4) Desinfectar el tapón de goma del frasco de Hemocultivo.
  3. 5) En todos los casos el desinfectante debe actuar durante 1 minuto.
  4. 6) No efectuar una nueva palpación luego de desinfectar la piel.
  5. 1) El personal debe realizarse higiene de manos previo al procedimiento.
  6. 2) Se debe colocar el barbijo, la bata con el gorrito.
2. B. VENOPUNCIÓN PERIFÉRICA
  1. 1) Colocar la ligadura en el paciente.
  2. 2) Desinfectar de nuevo la piel con clorhexidina alcohólica al 2%
  3. 3) Esperar que seque y olocarse los guantes estériles.
  4. 4) Extraer la sangre por punción venosa.
  5. 5) Inyectar directamente la sangre en el frasco de hemocultivo (no es necesario cambiar la aguja).
    1. Si se utilizan frascos para cultivo aerobio y anaerobio, inocular primero la botella para aerobios y luego la de anaerobios.
      1. Para hemocultivos de rutina (extraer 15ml)
        Introducir 10ml en el frasco #1 (tapa amarilla) y los 5ml restantes en el frasco #2 (uno de los frascos tapa azul).
      2. Para pacientes que estén recibiendo terapia antimicrobiana (extraer 10ml)
        Inocular 5ml en el frasco #1 (tapa amarilla) y los 5ml restantes en el frasco #2 (frasco tapa azul).
      3. Para cultivos de hongos (extraer 10ml)
        Inocular en el frasco #1 (tapa verde).
      4. Para cultivo de micobacterias (extraer 10ml)
        Inocular 5ml en el frasco #1 (frasco tapa blanca) y los 5ml restantes en el frasco #2 (frasco tapa blanca).
  6. 6) Mezclar suavemente los frascos utilizando la técnica de inversión.
  7. 7) Cambiar de guantes manteniendo la técnica aséptica y repetir el mismo procedimiento con la segunda venopunción (segundo sitio identificado) y distribuir como en el PASO 5.
  8. 8) Realizar la disposición final de residuos hospitalarios y material corto punzante teniendo en cuenta las normas de bioseguridad.
  9. 9) Colocar los frascos en una bolsa transparente, sellada y se envía al laboratorio clínico. El tiempo no debe exceder los 30 minutos.
  10. 10) Las muestras se transportan a temperatura ambiente.
3. C. VOLUMEN Y NÚMERO DE MUESTRAS
  1. Adultos
    1. Deben obtenerse dos muestras de hemocultivos.
    2. Cada muestra se inocula en uno o dos frascos, 10 ml en cada uno.
    3. En caso de fiebre de origen desconocido o endocarditis bacteriana subaguda se pueden extraer hasta tres muestras de hemocultivos en 24 horas.
  2. Neonatos, lactantes y niños
    1. Recomendación de número de muestras y volumen de acuerdo al siguiente Cuadro:
  3. Sensibilidad de deteccion por series de hemocultivos (2 frascos por extracción):
    1. Un volumen sanguíneo de 20 ml en cada extracción (10ml por frasco),
      1. Con la primera seriefue un 73,1%
      2. Con las dos primeras series fue el 89,7%
      3. Con las tres primeras series fue el 98,3% .
4. D. SISTEMAS DE HEMOCULTIVO
  1. Manuales
    1. Inoculacion de la muestra (10ml)
      1. Frasco con medio de cultivo (Anaerobico - Aerobico)
        Deteccion visual del desarrollo microbiano cada dia por 7 dias analizando turbidez, hemolisis, gas)
        tincion de GRAM, resiembre
        Siembra ciega a las 24h y 7 dias
  2. Automaticos
    1. Inoculacion de la muestra (10ml)
      1. Botella con medio de cultivo (Anaerobico-Aerobico-micobacterias-resinas)
        La computadora analizara el indice de crecimiento con el Grafico de crecimiento
        Descarga de botellas, tincion de GRAM, resiembra
        Eliminacion de botellas (sin subcultivo)
5. E. PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVO CONVENCIONAL
  1. a) Incubación
    1. Se efectúa a 35°C en atmósfera normal y se observará cada 18-24 h., durante 7 días.
    2. Se verificará la aparición:
      1. Turbiedad
      2. Cambios de color
      3. Hemólisis
      4. Burbujas de gas (no agitar el frasco al retirarlo de la estufa).
  2. c) Subcultivo
    1. El primer subcultivo y coloracion se haran en las primeras 24h.
      1. Habiendose observado o no alguna alteracion en los frascos (control ciego)
      2. En pediatria se hace en las primeras 6 horas.
    2. El subcultivo se realiza en Agar Chocolate.
      1. Si la coloracion de GRAM se observan:
        GRAM positivos
        Se agrega una placa con Agar Sangre
        GRAM negativos
        Agar CLDE
        Agar MacCokey
        Agar Levine
    3. Proceso
      1. a) Desinfectar el tapón de goma. Homogeneizar el medio.
      2. b) Invertir el frasco y extraer parte del caldo de cultivo con jeringa y aguja estéril (sujetar el émbolo fuertemente, por si existiera presión de gas)
      3. c) Depositar gotas de la muestra sobre la superficie del agar chocolate y estriar con ansa.
      4. d) Depositar una gota en un portaobjetos para efectuar coloración de Gram y/o tinción fluorescente con naranja de acridina
      5. e) Los subcultivos se deben incubar en atmósfera con tensión de CO2 aumentada (5-10%), por lo menos 72 h. Observar cada dia.
      6. e) El segundo subcultivo ciego se realiza a los 7 días, o cuando se observe alguna alteración.
  3. d) Interpretacion de los resultados
    1. Hemocultivo positivo
      1. Se considera significativo cuando:
        a) El mismo microorganismo se reitera en dos o más muestras
        b) Cuando se lo encuentra en una sola muestra, pero simultáneamente se lo recupera de otro material
        c) Cuando se lo recupera de una o más muestras, y el título de anticuerpos ante la cepa aislada es significativo o asciende durante la evolución del proceso (casos especiales).
        d) Cuando se recupera de una sola muestra, pero se trata de un patógeno rara vez aislado de piel o mucosa o coincide con el cuadro clínico característico
  4. b) Tinción de Gram
    1. 1) Colocar una "V" si se trata de un frasco aerobio o una "N" si es uno anaerobio.
    2. 2) Colocar sobre el correspondiente porta 1 o 2 gotas del contenido del tubo.
    3. 3) Extender la gota ligeramente con el asa
    4. 4) Realizar la tinción de Gram.
    5. 5) Observar al microscopio la presencia de microorganismos
      1. El resultado de la tinción se anotará en la hoja de trabajo por orden numérico.
        Si la tinción Gram es positiva
        Deben realizarse inmediatamente subcultivos para hacer técnicas rápidas (p.ej., diagnóstico molecular) para ofrecer una identificación adicional de organismos
        Si la tinción Gram es negativa
        No se le comunica al médico a menos que haya crecimiento en el subcultivo.
        Presencia de levaduras
        Se realizará una tinción de tinta china con el objeto de descartar de forma precoz Cryptococcus neoformans.
  5. e) Identificación y realización del antibiograma
    1. Según la observación de la coloración de Gram de las colonias que crecen en agar chocolate, se pueden iniciar las marchas de identificación correspondientes
      1. Primero desde el caldo de hemocultivo y, en forma confirmatoria, desde las colonias desarrolladas en agar chocolate
      2. El método de difusión se efectúan también a partir de las colonias y con inóculo controlado
      3. En casos especiales, se realizan pruebas de sensibilidad por Etest o dilución en medio líquido
6. F) LIMITACIONES
  1. Alguna contaminación eventual en los cultivos de sangre
  2. Pueden existir bacteriemias ocasionadas por microorganismos que no desarrollan en las condiciones de cultivo rutinarias.
    1. Francisella tularensis, Leptospira spp., Legionella spp., Brucella spp.
  3. Presencia de microorganismos con deficiencia en su pared celular pero se pueden recuperar en medios adicionados con sacarosa o manitol al 10%.
  4. Presencia de hongos o levaduras, se necesitara ventilacion al hemocultivo e incubar a 22-30°C durante un mes.
Identificacion Preliminar en tincion de GRAM

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