Biologia Molecular

Biologia Molecular

1. Investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese protéica.

2. Métodos

   • PCR = Reação em Cadeia Polimerase
     • +rápida +barata -amostras
     • amplificação (criação de múltiplas cópias) de DNA sem o uso de um organismos vivo - "in vitro"
     • Alternativa à...
       • Gera uma quantidade essencialmente ilimitada de uma sequência através de amplificação enzimática
     • Alternância de temperaturas
       • 3. extension: 72 °C
       • 2. anneal: 37 - 65 °C
       • 1. desnature: 94 - 96 ºC
     • Repetição de ciclos
       • 25 a 40 em média
     • Taq DNA polimerase
       • bactéria Thermus aquaticus
         • produz DNA polimerase
           • amplifica o DNA
             • anelamento com os primers em altas temperaturas.
     • Visualização dos produtos
     • Possíveis aplicações
       • I. Seleção de clones recombinantes
       • II. Sequenciamento direto de produtos amplificados
       • IV. Detecção de mutações em genes específicos
         • estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas
         • diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas
       • III. Estudos diagnósticos de doenças infecciosas
         • detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos
       • V. Diagnóstico pré-natal em caso de risco
       • VI. Grande potencial na Medicina Forense
         • impressão digital de DNA
   • CRISPR - CAS9
     • Edita genes
       • Corta o DNA com precisão
         • Permite que processos naturais de reparo assumam o controle
     • Um fragmento > de DNA pode ser excluído a partir de 2 RNA guias com alvos diferentes
       • Reparo dirigido por homologia
         • Adicionar um modelo de DNA ao lado da máquina CRISPR / CAS9
           • Correção ou adição de novo gene pela célula
       • União de extremidades não homólogas
         • Um único corte pode adicionar ou excluir pares de bases
           • Interrupção da sequência de DNA Ooriginal
             • Inativação do gene
       • Clivagem em cada local
         • União das extremidades não homólogas une as extremidades separadas
           • Exclusão da sequência interveniente
     • 2 partes
       • Enzima CAS9
         • Corta em um local especificado por um RNA guia
       • RNA guia
         • Molécula de RNA que se liga a CAS9
   • Eletroforese
     • Separação de moléculas
       • migração em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial
       • separadas de acordo com o seu tamanho
         • as de < massa migram + rapidamente
     • Géis de poliacrilamida ou agarose
       • Equipamento = Cuba de eletroforese
         • Visualização das bandas em transiluminador ultravioleta
           • Há um padrão
         • Cria corrente elétrica
     • Aplicações:
       • Teste de paternidade
       • Diferenciação de espécies ou linhagens
       • Engenharia genética
     • Facilidade de execução
       • Versatilidade de aplicações
         • Baixo custo
           • Precisão nos resultados
   • Clonagem
     • DNA recombinante
       • Moléculas de DNA que contêm segmentos ligados covalentemente, derivados de duas ou mais fontes de DNA
       • Sua produção requer corte e emenda de duas fitas de DNA de maneiras muito específicas
         • O corte é realizado por enzimas de restrição
           • Enzimas que catalisam a clivagem de ligações fosfato dentro da molécula de DNA.
           • Conhecidas aproximadamente 3.500
           • Sítios de reconhecimento com aproximadamente 4 ou 6 pares de bases
           • Palindrômicas
             • A sequência de bases no sítio de reconhecimento, é igual em ambos os filamentos quando são lidos de 5′ a 3′
           • Divididas em:
             • Abruptas
               • Clivagem no eixo de simetria
             • Coesivas
               • Clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria
     • Finalidade: isolar em grande quantidade um gene ou sequência específica de DNA.
       • Requer a transferência de uma sequência de DNA para microorganismo ou uma única célula, que irá se replicar
     • Vetores
       • Precisam ter:
         • Origem de replicação
           • Garantia que consiga se replicar dentro da célula
         • 1 ou + sítios únicos de restrição
           • fragmento de DNA possa ser inserido
         • Marcadores selecionáveis
           • Permitindo que todas as células que contenham o vetor consigam ser identificadas
       • DNA capaz de replicar automaticamente em um hospedeiro
     • Etapas
       • 1. Digestão
       • 2. Ligação
       • 3. Transformação
   • RT - PCR
     • Inicialmente é preciso fazer a transcrição reversa do RNA em cDNA
       • Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente com a PCR
     • RT = Reverse Transcriptase
     • DNA- Polimerase não usa RNA como “template”
   • PCR em tempo real
     • Cada vez que é sintetizada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão fluorescente
     • Resultado em 2 / 3 horas
     • Ampliação, detecção e quantificação do DNA em uma única etapa
     • Não precisa de eletroforese
     • Utilização de fluorocromo
   • Sequenciamento de Sanger
     • Não apresentam 3’-hidroxila
       • Se forem incorporados ao DNA, impedem que a DNA Polimerase se ligue com a próxima base complementar
     • Utilização de ddNTPs
       • Marcados por fluorescência característica
         • Permite a distinção das cadeias
     • Determina a sequência exata de nucleotídeos em uma molécula de DNA
   • Técnicas avançadas
     • Chips de poucos centímetros quadrados contém ácidos nucleicos fixados em centenas de milhares de spots.
       • O ácido nucleico em cada spot pode variar desde oligonucleotídeos de 25 bases até clones de cromossomos bacterianos artificiais de 350 kb.
         • Ocorre a hibridização das sondas de sequências específicas marcadas com corantes fluorescentes nos arranjos densos
           • Cada spot é examinado sob um microscópio de fluorescência
             • A luz de cada spot é quantificada.
     • Se a sonda contém uma mistura de dois corantes fluorescentes que emitem luz em diferentes comprimentos de onda, o brilho de cada um pode ser analisado, determinando as contribuições relativas de cada comprimento de onda à luz total emitida.
   • Terapia Gênica
     • Transferência de material genético novo para células de um indivíduo resultando em benefício terapêutico
     • 5a Revolução da Medicina
       • Há 20 anos