Biologia Molecular

Investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese protéica.
Métodos
1. PCR = Reação em Cadeia Polimerase
  1. +rápida +barata -amostras
  2. amplificação (criação de múltiplas cópias) de DNA sem o uso de um organismos vivo - "in vitro"
  3. Alternativa à...
    1. Gera uma quantidade essencialmente ilimitada de uma sequência através de amplificação enzimática
  4. Alternância de temperaturas
    1. 3. extension: 72 °C
    2. 2. anneal: 37 - 65 °C
    3. 1. desnature: 94 - 96 ºC
  5. Repetição de ciclos
    1. 25 a 40 em média
  6. Taq DNA polimerase
    1. bactéria Thermus aquaticus
      1. produz DNA polimerase
        amplifica o DNA
        anelamento com os primers em altas temperaturas.
  7. Visualização dos produtos
  8. Possíveis aplicações
    1. I. Seleção de clones recombinantes
    2. II. Sequenciamento direto de produtos amplificados
    3. IV. Detecção de mutações em genes específicos
      1. estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas
      2. diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas
    4. III. Estudos diagnósticos de doenças infecciosas
      1. detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos
    5. V. Diagnóstico pré-natal em caso de risco
    6. VI. Grande potencial na Medicina Forense
      1. impressão digital de DNA
2. CRISPR - CAS9
  1. Edita genes
    1. Corta o DNA com precisão
      1. Permite que processos naturais de reparo assumam o controle
  2. Um fragmento > de DNA pode ser excluído a partir de 2 RNA guias com alvos diferentes
    1. Reparo dirigido por homologia
      1. Adicionar um modelo de DNA ao lado da máquina CRISPR / CAS9
        Correção ou adição de novo gene pela célula
    2. União de extremidades não homólogas
      1. Um único corte pode adicionar ou excluir pares de bases
        Interrupção da sequência de DNA Ooriginal
        Inativação do gene
    3. Clivagem em cada local
      1. União das extremidades não homólogas une as extremidades separadas
        Exclusão da sequência interveniente
  3. 2 partes
    1. Enzima CAS9
      1. Corta em um local especificado por um RNA guia
    2. RNA guia
      1. Molécula de RNA que se liga a CAS9
3. Eletroforese
  1. Separação de moléculas
    1. migração em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial
    2. separadas de acordo com o seu tamanho
      1. as de < massa migram + rapidamente
  2. Géis de poliacrilamida ou agarose
    1. Equipamento = Cuba de eletroforese
      1. Visualização das bandas em transiluminador ultravioleta
        Há um padrão
      2. Cria corrente elétrica
  3. Aplicações:
    1. Teste de paternidade
    2. Diferenciação de espécies ou linhagens
    3. Engenharia genética
  4. Facilidade de execução
    1. Versatilidade de aplicações
      1. Baixo custo
        Precisão nos resultados
4. Clonagem
  1. DNA recombinante
    1. Moléculas de DNA que contêm segmentos ligados covalentemente, derivados de duas ou mais fontes de DNA
    2. Sua produção requer corte e emenda de duas fitas de DNA de maneiras muito específicas
      1. O corte é realizado por enzimas de restrição
        Enzimas que catalisam a clivagem de ligações fosfato dentro da molécula de DNA.
        Conhecidas aproximadamente 3.500
        Sítios de reconhecimento com aproximadamente 4 ou 6 pares de bases
        Palindrômicas
        A sequência de bases no sítio de reconhecimento, é igual em ambos os filamentos quando são lidos de 5′ a 3′
        Divididas em:
        Abruptas
        Clivagem no eixo de simetria
        Coesivas
        Clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria
  2. Finalidade: isolar em grande quantidade um gene ou sequência específica de DNA.
    1. Requer a transferência de uma sequência de DNA para microorganismo ou uma única célula, que irá se replicar
  3. Vetores
    1. Precisam ter:
      1. Origem de replicação
        Garantia que consiga se replicar dentro da célula
      2. 1 ou + sítios únicos de restrição
        fragmento de DNA possa ser inserido
      3. Marcadores selecionáveis
        Permitindo que todas as células que contenham o vetor consigam ser identificadas
    2. DNA capaz de replicar automaticamente em um hospedeiro
  4. Etapas
    1. 1. Digestão
    2. 2. Ligação
    3. 3. Transformação
5. RT - PCR
  1. Inicialmente é preciso fazer a transcrição reversa do RNA em cDNA
    1. Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente com a PCR
  2. RT = Reverse Transcriptase
  3. DNA- Polimerase não usa RNA como “template”
6. PCR em tempo real
  1. Cada vez que é sintetizada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão fluorescente
  2. Resultado em 2 / 3 horas
  3. Ampliação, detecção e quantificação do DNA em uma única etapa
  4. Não precisa de eletroforese
  5. Utilização de fluorocromo
7. Sequenciamento de Sanger
  1. Não apresentam 3’-hidroxila
    1. Se forem incorporados ao DNA, impedem que a DNA Polimerase se ligue com a próxima base complementar
  2. Utilização de ddNTPs
    1. Marcados por fluorescência característica
      1. Permite a distinção das cadeias
  3. Determina a sequência exata de nucleotídeos em uma molécula de DNA
8. Técnicas avançadas
  1. Chips de poucos centímetros quadrados contém ácidos nucleicos fixados em centenas de milhares de spots.
    1. O ácido nucleico em cada spot pode variar desde oligonucleotídeos de 25 bases até clones de cromossomos bacterianos artificiais de 350 kb.
      1. Ocorre a hibridização das sondas de sequências específicas marcadas com corantes fluorescentes nos arranjos densos
        Cada spot é examinado sob um microscópio de fluorescência
        A luz de cada spot é quantificada.
  2. Se a sonda contém uma mistura de dois corantes fluorescentes que emitem luz em diferentes comprimentos de onda, o brilho de cada um pode ser analisado, determinando as contribuições relativas de cada comprimento de onda à luz total emitida.
9. Terapia Gênica
  1. Transferência de material genético novo para células de um indivíduo resultando em benefício terapêutico
  2. 5a Revolução da Medicina
    1. Há 20 anos

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