Upstream

Upstream

1. Transformação do substrato desejado em produto metabólico

2. Seleção de células

   • Bactérias
     • E. coli
     • Produção de baixo custo, rápido crescimento, bem caracterizado, fácil manipulação
     • Necessidade de eliminação de toxinas e pirogênios
   • Fungos
     • Ex.: Pichia pastores, Saccharomyces cerevisae
       • Meio de cultivo simples e barato com rápido crescimento e produção
       • Livre de oncogenes, endotoxinas e partículas virais
   • Algas
   • Células de mamíferos
     • Alta labilidade
     • Baixas taxas de crescimento
     • Ex.: CHO, HeLa, células de rim humano, fibrblastos, etc
     • Cultivo complexo, custoso e caro
     • Possibilidade de contaminações
     • Necessidade de equipamentos especificos
   • Insetos
     • Spodoptera frugiperda
       • facilidade de manutenção das células
   • Meio de cultura
     • Inóculo Primário
       • Biorreator (grande escala)
         • Separação e extração
           • Sem retenção de células
             • o meio fresco é alimentado para o biorreator
             • meio gasto contendo ambos as células e o produto são removidos na mesma taxa
             • Nenhum dispositivo de separação é usado para retêm células, de modo que as concentrações de células no fluxo de colheita e no biorreator são iguais
             • Exemplo de uso: produção do Fator IX da coagulação
             • Em sistemas com células de mamíferos alcança baixa produtividade e densidade celular
           • Cromatografia (Downstream)
           • Com retenção de células
             • Separadas por perfusor
               • Filtração de fibra oca
                 • Dispositivos de retenção de células que podem aliviar algumas das preocupações em torno dos filtros de rotação
                 • Densidade ultra-alta, a viscosidade da cultura e o pCO 2 dissolvido tornaram-se limitação
                 • Tem sido frequentemente considerada como um meio para inóculos de alta densidade.
               • Filtros flutuantes
                 • Têm sido usados ​​para cultivar células em densidades acima de 20 milhões de células / mL
                 • São propensos a entupir e normalmente são usados ​​apenas na ordem de 10 dias
               • Filtração de fluxo de vórtice (VFF)
                 • Consiste em um cilindro rotativo interno rodeado por um filtro concêntrico
                 • A cultura celular é enviada para o espaço anular e livre de células o sobrenadante é puxado através do filtro e para fora do espaço anular
                 • O interno cilindro rotativo forma vórtices Taylor que impedem a polarização da concentração e deposição de partículas no filtro
                 • O aumento de escala pode apresentar desafios já que o diâmetro do VFF precisa aumentar quadraticamente com o diâmetro do biorreator
                 • Corridas de baixa densidade e longa duração
               • Os sistemas imobilizados não sofrem de washout em nenhuma taxa de perfusão, as células são geralmente protegido de cisalhamento, e altas densidades de células compactadas são possíveis
               • As desvantagens da imobilização incluem heterogeneidade célula a célula, represen- amostragem ativa e monitoramento preciso da biomassa, oxigênio e nutrientes pobres transferência e difícil aumento de escala
               • Filtração por spin
                 • o sobrenadante da cultura de células é bombeado para um filtro cilíndrico e para fora do biorreator
                 • Evita obstrução de células na membrana
                 • A incrustação é agravada por superfícies de filtro carregadas e mídia à base de soro, adição de antiespumante, alto taxas de perfusão, altas concentrações de células, baixas velocidades de rotação do filtro e baixo área de superfície do filtro
                 • A tecnologia foi dimensionada para permitir a perfusão em escala piloto biorreatores com 175L e 500L volumes de trabalho
             • Com base na densidade
               • Centrífugas
                 • Depende das diferenças de densidade para a célula retenção
                 • A centrífuga Centritech usa fluxo ortogonal contínuo e possui um dispositivo inserção capaz (fixada em um rotor cônico) para coleta e separação de cultura de células
               • Hidrociclones
                 • Dispositivo cônico simples que usa forças centrífugas para separar componentes por densidade
                 • A cultura de células entra em alta velocidade e circunda o cone
                 • São de baixo custo, não possuem partes móveis e podem ser aplicados prontamente para sistemas descartáveis ​​e de limpeza no local / vaporização no local
                 • Volumes menores requerem perfusão intermitente porque a redução adicional do hidrociclone não é viável
                 • São capazes de 90% de células eficiências de retenção
               • Colonizadores gravitacionais
                 • Se a cultura puder ser bombeada para cima a uma taxa mais lenta do que a velocidade de estabilização da célula
                 • As células podem ser cultivadas em microtransportadores suspensos
                 • Pontos negativos: cisalhamento de agitação, cisalhamento de agitação, heterogeidade célula a célula, problemas na estratificação
                 • Decantadores com placas paralelas inclinadas foram projetados para criar fluxo laminar e alavancar o efeito de boicote para permitir que as células se acomodem, se acumulem e descam a placa inferior com eficiência de separação aprimorada
                 • O tempo de residência pode ser diminuiu pelo resfriamento e vibração do decantador, bem como o período de lavagem normalmente com gás
                 • São adequados para operações de longa duração
                 • Excelente capacidade de reter células viáveis ​​e remover células mortas menores por meio do perfusato
                 • Desvantagens: As densidades celulares têm só foi demonstrado até 20-30 milhões de células / mL; acima desse intervalo, retenção a eficiência cai drasticamente e as células passam para a colheita. Separador os tempos de residência são bastante longos. Detritos e algumas células saem do biorreator no fluxo de colheita de um sistema gravitacional decantador, uma etapa de clarificação adicional é necessária se a operação de purificação a jusante as ações são integradas
               • Assentamento acústico
                 • Prendem as células nos nós de pressão das ondas ultrassônicas estacionárias
                 • Não requerem peças móveis, podem ser facilmente limpos e esterilizados e não requerem nenhuma barreira física para separação de células e, portanto, não são propensos a incrustação
                 • Uma vez presas, as células se agregam e, em seguida, se acomodam de volta no reator por gravidade
                 • Permiti taxas de perfusão de até 200 L / dia para volumes de trabalho do biorreator de 100 L
         • Descontínuo
           • Concentrações elevadas de substrato inibem o agente biológico
           • Plasmólise celular
           • Inibição pelo produto
         • Descontínuo alimentado
           • Inicialmente se introduz o inóculo, ocupando um uma fração do volume útil da ordem de 10 a 20%
           • Pode-se incluir o reciclo de células a fim de se iniciar um novo período de alimentação
           • Alimentação pode ser constante ou intermitente, com vazões constantes ou não
         • Contínuo
           • As células podem ser mantidas em estado fisiológico e crescimento constantes
           • Cultivo mais longo que a batelada
           • Permite que o cultivo seja acoplado a outras operações da planta, otimizando assim a produtividade total da plant
           • Reatores e equipamentos associados menores, gerando menor custo e maior lucro
           • Maior risco de contaminação
           • Produção de produtos terapêuticos não é recomendado
     • Quanto maior a complexidade da célula, maior o requerimento nutricional
     • Água, sais inorgânicos, ácidos orgânicos, açúcares, aminoácidos, vitaminas, lipídeos, proteínas, hormônios, fontes de carbono e nitrogênio, íos inorgânicos, sais minerais
     • Soro fetal bovino - suplementação
       • Investigação de príons
       • Em desuso por questões éticas e ambientais
       • Com a retirada é possível fazer uma cultura em suspensão, já que as proteínas do soro geram a adesão
     • Meios: BME; EME; DMEM; GMEM; RPMI; Leibovitz; Alfa MEM; Ham´s F10, F12 e F14; IMDM; MCDB; KO-DMEM
     • Esterilização por filtração ou autoclave por calor úmido
     • O2 21%
     • Temp.: 37ºC
     • pH 7.2 -7.4
     • Geração de radicais livres
     • Morte provocada por contato
     • Contaminação de microorganismos

3. Sistema de expressão

4. Ex.: vacina, anticorpos e proteínas terapêuticas