PCR

PCR - Analítica.

Consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico.

Pasos.

Reactivos.

Muestra de ADN que contenga la región(es) que se desea amplificar, Buffer o solución amortiguadora, Cloruro de Magnesio (MgCl2), Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs), Iniciadores, Taq polimerasa, Agua destilada o desionizada estéril

1. Preparación de la muestra.

En un tubo para PCR se agregan los siguientes reactivos:

ADN molde, los iniciadores, los nucleótidos o dNTPs, la solución amortiguadora, el cloruro de magnesio (MgCl2), el agua y la ADN polimerasa

Mezclar los componentes de la reacción con un vórtex durante 2-3 segundos o dando unos golpecitos con el dedo o invirtiendo el tubo varias veces

Centrifugar brevemente para reunir la mezcla en el fondo del tubo

2. Amplificación: Consiste en desnaturalización, alineamiento y amplificación

a. Desnaturalización inicial

Habitualmente la PCR utiliza un ciclo de desnaturalización. Se conseguiría elevando la temperatura del tubo de reacción hasta 94º por 30 segundos a 2 minutos.

b. Alineamiento.

Disminuir la temperatura de los incubadores entre e 45 y 65 ºC durante un tiempo entre 30 segundos y 1 minuto.

c. Extensión.

Elevar la temperatura a 72 ºC porque es la temperatura a la cual la Taq polimerasa (enzima más utilizada) alcanza su mayor actividad.

Se realizan ciclos desnaturalización, alineamiento y extensión entre 25 a 35 veces.

Por último realizar una extensión final de aproximadamente 5 minutos a 72 ºC para permitir que la polimerasa termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos

Electroforesis.

La electroforesis en gel es una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño.

Diego Castro - Paralelo 11

Bibliografía:

Serrato A, Flores L, Aportela J (2015), PCR: reacción en cadena de la polimerasa, recuperado de: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf

Khan Academy (2017) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), recuperado de: https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr

OMS (2013), Manual para el diagnóstico de laboratorio de la infección por los virus del sarampión y de la rubéola, recuperado de: https://www.who.int/ihr/elibrary/manual_diagn_lab_mea_rub_sp.pdf