FERRAMENTAS DE GENÉTICA MOLECULAR APLICADAS À GENÉTICA MÉDICA POR CAMILA SIQUEIRA TITO

FERRAMENTAS DE GENÉTICA MOLECULAR APLICADAS À GENÉTICA MÉDICA POR CAMILA SIQUEIRA TITO

1. BIOLOGIA MOLECULAR

   • Investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese proteica. As informações necessárias para o funcionamento do organismo estão contidas nessas moléculas. Importante para o diagnóstico, medicina preventiva e farmacogenômica

2. EXAME PCR

   • Reação em cadeia da polimerase, que ocorre por alternância de temperaturas. DNA polimerase + primers
     • Replicação de parte do material genético em várias quantidades para análise. Alternativa à clonagem para gerar uma quantidade essencialmente ilimitada de uma sequência através de amplificação enzimática. Fragmento de DNA localizado entre dois iniciadores (primers, oligonucleotídeos). Primers são projetados de modo que um é complementar para cada lado da dupla hélice do DNA. O PCR amplifica uma sequência alvo. Replicação in vitro do DNA (só do gene que interessa). PCR é uma técnica extremamente sensível, mais rápida, mais barata, requer menos amostras
       • ALTERNÂNCIA DE TEMPERATURA
         • Desnaturação: para abrir a fita de DNA (94-65°c)
         • Anelamento: liga o primer a fita de DNA (37-65°C)
         • Polimerização: temperatura ótima para funcionamento da DNA polimerase (72°C)
   • APLIAÇÕES
     • Seleção de clones recombinantes
     • Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas, estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas)
     • Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitas
     • Diagnóstico pré-natal em caso de risco

3. ELETROFORESE

   • Repara moléculas (DNA, RNA, proteínas e enzimas) com cargas ou tamanhos diferentes. Existe um padrão de peso, para saber se o PCR funcionou e se tem as copias do gene certo. Fornece meios para responder perguntas. O PCR sozinho não te da nada, precisa ser usado em conjunto com um método de análise, por exemplo, a eletroforese
   • COMO É FEITO
     • Passa-se uma corrente elétrica por um liquido condutor; pequenos fragmentes de moléculas migram mais rápido que os maiores e com o passar do tempo, os fragmentos se separam por tamanho. Ao comparar a distância de migração de fragmentos desconhecidos com a distância viajada pelos padrões de tamanho, pode-se determinar o tamanho aproximado dos fragmentos desconhecidos. Por comparação, podemos inferir se o primer se anelou corretamente, pois encontrou-se um tamanho de gene que está dentro da expectativa. Se na eletroforese deu tamanho aproximado, provável que o teste deu certo.
   • OBS:Fragmentos corados podem ser visualizados ao usar um corante especifico para ácidos nucleicos ou marcar os fragmentos com corante químico. Contudo, não se sabe quais são as bases nitrogenadas encontradas, ou seja, não tenho uma sequência de bases para o gene especifico que me dê a resposta do problema que quero resolver, para isso é preciso ampliar a eletroforese e o sequenciamento que vai me dar os nucleotídeos.

4. EXAME PT-PCR

   • Usada para obter clones genômicos ou de DNAc (convertido) adicionando a transcriptase reversa
   • Primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA em DNA convertido (RNAm convertido em DNAc). Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente com o PCR. Cada vez que é sintetizada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão fluorescente.
   • OBS: É mais fácil trabalhar com o DNAc do que com o DNA, pois ele é menor (uma fita), mais fácil de sequenciar (unidirecional), todos os introns foram retiradas, já possui o “código” para ser traduzido em proteína.

5. REAL TIME PCR

   • Quantificação em tempo real. Cada vez que é sintetizada uma nova fita há aumento de intensidade. Tem-se uma modificação da reação em cadeia da polimerase, que determina de forma quantitativa o ácido nucleico inicial, na qual a quantidade de DNA amplificada é verificada a medida que a reação prossegue
   • PCR Real Time + PCR RT: essas duas técnicas podem quantificar o RNAm em uma amostra, permitindo que seja determinado o nível de expressão genica em diferentes células e em diferentes condições

6. MUTAÇÃO E POLIMORFISMO

   • MUTAÇÃO
     • Está relacionada ao aparecimento de alguma alteração fenotípica
   • POLIMORFISMO
     • Quando uma variante genética alcança uma frequência de 1% na população (se for menor, é mutação) e não é letal é denominada de polimorfismo
     • POLIMORFISMO GENÉTICO: variações nas sequências de DNA que ocorrem na população geral de forma estável e comum, sendo encontradas com frequência de 1% ou mais (marcadores genéticos moleculares)
     • POLIMORFISMO DE DNA: mutações pontuais de substituição, inserção, deleção, macro rearranjos, translocações, inversões
     • POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNP): variação na sequência de DNA que afeta somente uma base na sequência do genoma: São consideradas multifatoriais, pois são causadas por um conjunto de fatores ambientais e pelo somatório de vários alelos de diferentes genes relacionados, aumentando a suscetibilidade para a patologia.
     • POLIMORFISMO DE MINISSATÉLITES (VTNR): são sequencias nucleotídicas repetidas que variam no número de ocorrências do motivo básico

7. MICROSSATÉLITES

   • São sequencias simples de repetições que podem ou não fazer parte da codificação, ou seja, se for em uma região não codificadora (introns), não originam proteínas ou sistemas de controle e são comuns em nosso DNA. Podem fazer parte de sistemas de controle ou codificar algo.
   • Altamente reprodutível, é o que menos altera de uma geração para outra
   • Possíveis causas de poliformismo de microssatélites: escorregamento da DNApol (polimerase) na replicação ou crossing over desigual entre cromátides irmãs
   • Possível analisar a proximidade entre indivíduos ou espécies (se a maioria bater, há parentesco).

8. SEQUENCIAMENTO

   • Determina de forma rápida a sequência de bases no DNA, o que permite que a informação genética no DNA seja lida, fornecendo muita informação sobre a estrutura e função dos genes
   • ETAPAS
     • O resultado nos permite parear as bases e saber a sequência de bases da amostra DNA
     • Uma amostra de DNA é distribuída dentro de quatro tubos, casa um com uma base (DNA que sabemos o tamanho pela eletroforese)
     • Os tubos são aquecidos para que ocorra a desnaturação, o primer se anelar e a DNA polimerase polimerizar
     • Um desoxinucleotideos (DNTPs) se liga, aleatoriamente, a região terminal, não tendo OH livre, então bloqueia a síntese de DNA (milhares de processos são interrompidos, moléculas de DNA são sintetizadas de vários tamanhos em cada tubo)
     • É feita a eletroforese para separar as bases por tamanho, que organizadas e localizado os marcadores de didesoxinucleotideos (DDNTP), em que cada coluna representa um DDNTP de um tubo, cada banda mostra o tamanho da molécula de DNA com DDNTP especifico o fim da cadeia, a banda mais inferior representa a cadeia interrompida por DDNTP mais curta
     • Ao sabermos o DDNTP do final da fita, podemos organizá-los e obter a cópia da fita molde (que a princípio não sabíamos)
   • SEQUENCIADORES AUTOMÁTICOS
     • Um tubo com as 4 bases. DDNTPs são marcadores por fluorescência característica (cada base, uma cor), permitindo a distinção das cadeias pela respectiva fluorescência. Cada fragmento recebe um feixe de laser argônio, que será detectado por um sistema óptico e uma câmara de CCD. A ordem que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar a cadeia usada como molde .
       • Os picos correspondem aos ddNTP e depois, se converte em fita molde

9. CLONAGEM

   • Combinação de DNA de duas espécies
   • Objetivo de isolar, em grande quantidade, um gene ou sequencia especifica de DNA e requer transferência dessa sequência para uma outra célula que irá se replicar
   • ETAPAS
     • Digestão: quebra com a endonucleases de restrição o gene e o plasmídeo, deixando com extremidades coesivas
     • Ligação: ligase combina (anela) gene e plasmídeo (vetor)
     • Transformação: inserção em uma célula hospedeira
     • Plaqueamento e Replicação: seleciono o que sobreviveu e coloca em um meio para que haja reaplicação e produza clones
   • APLICAÇÕES
     • Análise do genoma do DNA, fazer proteínas em bactérias, analisar estruturas e expressões do RNAm, ler sequencias de DNA e predizer sequencias proteicas, colocar um gene modificado em uma espécie alvo.

10. CRISPR - CAS 9

    • As CRISPRs são compostas por uma série de tais sequências palindrômicas, separadas por sequencias únicas que são homólogas para o DNA do bacteriófago ou dos genomas dos plasmídeos
    • Atuam na defesa contra a invasão de DNAs estranhos específicos, usando os DNAs oriundos de bacteriófagos e plasmídeos
    • Enzimas CAS9 são endonucleases, quebram o vírus, ligam e guardam o código na bactéria